扶正抑瘤汤对卵巢癌肺转移模型裸鼠血管新生及肺转移的影响.pdf

基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 (扫一扫查看文中图片)第一作者:史霞,E-m a i l:s x h a i t o n g 1 6 3.c o m 扶正抑瘤汤对卵巢癌肺转移模型裸鼠 血管新生及肺转移的影响史 霞,曹伟彬(甘肃省定西市第二人民医院,甘肃 定西7 4 3 0 0 0)【摘要】目的:探讨扶正抑瘤汤对转移性卵巢癌血管新生及肺转移的影响。方法:将2 0只B A L B/c裸鼠随机分为正常对照组、模型组、扶正抑瘤汤低剂量组0.5g(生药)/2 0g扶正抑瘤汤浸提液、扶正抑瘤汤高剂量组1.0g(生药)/2 0g扶正抑瘤汤浸提液,每组5只。裸鼠尾静脉注射卵巢癌细胞(S KVO 3)建立卵巢癌肺转移模型。检测各组裸鼠原位瘤瘤重、肺结节计数评分,计算瘤重抑制率和肺转移抑制率,并检测原位瘤中微血管密度及肺组织中表皮生长因子受体(E G F R)、血管内皮生长因子(V E G F)及激酶插入区受体(K D R)表达水平。结果:与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组原位瘤瘤重及肺结节计数评分均较低(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组原位瘤瘤重及肺结节计数评分均低于扶正抑瘤汤低剂量组(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组瘤重抑制率及肺转移抑制率均高于扶正抑瘤汤低剂量组。与正常对照组比较,模型组微血管密度增加(P0.0 5)。与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组微血管密度均减少(P0.0 5)。与正常对照组比较,模型组E G F R、V E G F及K D R表达水平均升高(P0.0 5)。与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组E G F R、V E G F及K D R表达水平均降低(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组E G F R、V E G F及K D R表达水平低于扶正抑瘤汤低剂量组(P0.0 5)。结论:扶正抑瘤汤可有效抑制卵巢癌裸鼠的血管新生和肺转移。【关键词】卵巢癌;肺转移;血管新生;扶正抑瘤汤;抗肿瘤方剂;赵健雄中图分类号:R 2 8 5.5 文献标识码:A D O I:1 0.1 9 6 2 1/j.c n k i.1 1-3 5 5 5/r.2 0 2 3.1 4 2 4 卵巢癌的复发与转移是卵巢癌生存率低的主要原因,其中肺是卵巢癌向内脏转移的常见部位。临床对于卵巢癌肺转移的治疗目前常用的方法是化疗,但其作用有限且不良反应较大1-2。中医药在提高肿瘤患者放化疗的敏感性,减少肿瘤患者放化疗的不良反应和并发症,以及提高生活质量和延长生存时间等方面具有显著优势3-5。扶正抑瘤汤是甘肃省名老中医赵健雄教授基于“扶正祛邪”理论研制而成的抗肿瘤方剂,在临床中取得了一定疗效6,但关于抑制卵巢癌复发与转移的作用机制未明。本研究通过建立卵巢癌细胞(S K V O 3)裸鼠肺转移模型,观察扶正抑瘤汤对卵巢癌肿瘤生长、血管生成指标(微血管密度)及肺转移的影响。1 材料1.1 药物 红芪(批号1 6 0 6 2 7)、当归(批号1 6 0 7 1 3)、莪术(批号1 6 0 5 2 5)、墓头回(批号1 6 0 5 0 3),均购自甘肃复兴厚中药饮片药业有限公司。1.2 细胞株 卵巢癌细胞(S KVO 3)购于湖南丰晖生物科技有限公司,批号为C L 0 2 8 8。R PM 1 1 6 4 0培养基含1 0%胎牛血清,5 0k U/L青霉素钠(河南新乡华星药厂,国药准字H 4 1 0 2 0 5 1 5)。将S KVO 3细胞放入3 7、5%二氧化碳(C O2)细胞培养箱中培养,待细胞长至7 0%8 0%后用0.2 5%胰蛋白酶消化后传代,取处于对数生长期的细胞进行后续实验。1.3 动物 5周龄B A L B/c裸鼠,1 52 0g,雄雌不限,共2 0只,购于四川成都达硕生物有限公司,动物许可证号为S Y X K(川)2 0 1 9-1 8 9。B A L B/c裸鼠饲养在温度(2 21)、湿度6 5%7 0%和昼夜循环(光照1 2h、暗照1 2h)受控的空调室内,正常进食和饮水。所有实验程序均经四川里来思诺生物科技有限公司批准(伦理编号为L L S N-2 0 2 1 0 0 2),并符合2 0 1 6版 实验动物管理和使用指南 相关要求。1.4 试剂及仪器 放射免疫沉淀实验(R I P A)裂解缓08 中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4冲液(美国A b c a m,货号A b 1 5 6 0 3 4),B r a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒(中国B e y o t i m e,货号P 0 0 0 6),R a p i d S t e pTME C L试剂(德国M e c r k,货号3 4 5 8 1 8),a n t i-V E G Fa n t i b o d y(美国A b c a m,货号a b 1 3 4 1 9 1),a n t i-C D3 4a n t i b o d y(美国A b c a m,货号a b 8 1 5 8),a n t i-E G F Ra n t i b o d y(美国A b c a m,货 号a b 5 2 8 9 4),a n t i-K D R a n t i b o d y(美 国S i g m a-A l d r i c h,货号S A B 4 3 0 0 3 5 7),S D S-P AG E凝胶制备试剂盒(S e r v i c e b i o公司,货号:G 2 0 0 3),脱脂奶粉(S e r v i c e b i o公 司,货 号:G C 3 1 0 0 0 1),显 影 定 影 试 剂(S e r v i c e b i o公司,货号:G 2 0 1 9),P V D F膜(S e r v i c e b i o公司,货号:G 6 0 1 5),T r i s-b u f f e r(S e r v i c e b i o公司,货号:B 8 1 6 0),b e t aA c t i na n t i b o d y(S e r v i c e b i o公司,货号:G B 1 5 0 0 3),G o a tA n t i-M o u s eI g G H&L(HR P)(美国A b c a m公司,货号:a b 2 0 5 7 1 9,a b 6 7 2 1),胎牛血清(中国B e y o t i m e,货号C 0 2 2 7),R PM 1 1 6 4 0培养基(美国T h e r m oF i s h e r,货号3 1 8 7 0 0 8 2),异戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,国药准字H 3 1 0 2 0 2 4 0),1 0%多聚甲醛溶液(青岛捷世康生物科技有限公司,货号:R Y 0 4 0 0,规格:5 0 0m L),山羊血清(郑州德宁生物技术有限公司,货号:D X 1 0 8,规格:1 0 0m L),磷酸盐缓冲液(P B S缓冲液)(郑州德宁生物技术有限公司,货号:D X 5 0 1,规格:5 0 0m L),二胺基联苯胺(D A B)显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:D A 1 0 1 0,规格:1 0m L),内源性过氧化物酶阻断液(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号:E-I R-R 1 1 5,规格:2 0m L),C O2培养箱(型号MC O-1 5 A C,日本三洋公司),电子天平(美国S a r t o r i u s,G L 2 2 4-1 S C N)。扶正抑瘤汤制备:将红芪(9 0g)、当归(3 0g)、莪术(3 0g)、墓头回(9 0g)混合后,用纯净水浸泡4 0 m i n后开始煎煮,共煎煮3次,每次加水3L。收集3次煎煮后的药液,合并后浓缩为含生药1g/m L的浸提液,-2 0保存备用。2 方法2.1 造模及分组给药 2 0只裸鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、扶正抑瘤汤低剂量组、扶正抑瘤汤高剂量组,每组5只。参考文献7 建立裸鼠卵巢癌肺转移模型。将处于对数期的S KVO 3细胞悬浮液(浓度11 05/m L)经尾静脉注射到B A L B/c裸鼠,建立肿瘤血循环转移模型,接种量为0.1m L/只。裸鼠肺转移结节形成,表明卵巢癌肺转移模型造模成功。在接种S KVO 3细胞悬浮液第5日之后,扶正抑瘤汤低剂量组灌胃0.5g(生药)/2 0g扶正抑瘤汤浸提液,扶正抑瘤汤高剂量组灌胃1.0g(生药)/2 0g扶正抑瘤汤浸提液,正常对照组和模型组灌胃等量0.9%氯化钠注射液,每天1次,连续给药3 0d。2.2 取材 给药3 0d后,用异戊巴比妥钠(0.1m g/g)麻醉裸鼠,摘除原位肿瘤并剔除周围组织,测量原发性肿瘤的大小和重量,计算抑瘤率 抑瘤率%=(1-扶正抑瘤汤组平均瘤重量/模型组平均瘤重量)1 0 0%。沿胸部正中切口打开胸腔,取出裸鼠双侧肺脏,用电子天平(美国S a r t o r i u s)称量原位瘤及肺脏重量并记录。肺组织置于B o u i n氏液中固定4 8h后,肺组织上的转移灶呈白色隆起,肉眼可见肿瘤转移灶大小及数目,比较肺结节计数总评分,计算肺转移抑制率。肺结节计数分级标准:瘤径0.5 mm,计1分;瘤径0.51mm,计2分;瘤 径1 2 mm,计3分;瘤 径2mm,计4分。将取出的原位瘤组织及肺组织置于-8 0冰箱中保存备用。2.3 免疫组化染色 原位瘤组织在1 0%多聚甲醛溶液中固定2 4h,石蜡包埋,切片后进行免疫组化染色。肿瘤组织在5m处连续切片,脱蜡水化,抗原修复,内源性过氧化氢酶阻断,非特异性抗原(山羊血清)封闭,吸去封闭液,与a n t i-C D3 4a n t i b o d y在4 下孵育过夜。然后用含有1%B S A的P B S缓冲液清洗切片,并与二抗(HR P标记的山羊抗小鼠I g G抗体)在3 7孵育3 0m i n,含有1%B S A的P B S缓冲液清洗切片,滴加2%D A B溶液显色5m i n,流水冲洗。再用苏木精对细胞核进行复染,流水冲洗,返蓝处理1 0m i n,流水冲洗,梯度乙醇(7 0%、8 0%、9 0%、9 5%、1 0 0%,每次2m i n)脱水,二甲苯透明处理,滴加树脂封片,室温风干。免疫染色结果由两名对实验不知情的独立研究人员进行评估,计数肿瘤着色的微血管和毛细血管,在肿瘤组织中凡染成棕黄色的内皮细胞簇或单个内皮细胞,均作为1个血管计数,但是管腔面积大于8个红细胞直径及肌层较厚的血管不计数。先在低倍镜下选择5个MV D最高区域,然后再在高倍镜(4 0 0)下计数5个区域中C D3 4标记的血管数目,最后取其平均值作为其微血管密度值。2.4 蛋白质印迹检测 把肺组织从液氮中取出,低温快速研磨成匀浆,使用R I P A裂解缓冲液提取蛋白,并通过B r a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒进行定量18中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 检测。提取的蛋白通过S D S-P A G E电泳分离,然后转移到聚偏二氟乙烯膜(P V D F)膜上,再用T r i s-b u f f e r稀释的5%的脱脂奶粉封闭2h,随后,滴加5 0L的一 抗(a n t i-V E G Fa n t i b o d y,a n t i-E G F R a n t i b o d y,a n t i-K D Ra n t i b o d y),4孵育过夜,P B S缓冲液洗膜,滴加二抗G o a tA n t i-M o u s e I g G H&L(HR P),室温下与膜孵育1h。最后,采用R a p i d S t e pTME C L试剂显影目的条带。-肌动蛋白用作内参。采用i m a g eJ软件计算各组灰度值,并采用S P S S统计软件分析结果的差异性。2.5 统计学方法 采用S P S S1 7.0统计软件分析数据。服从正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示。多组间比较采用单因素方差分析,当方差齐时两两 比 较 采 用L S D-t检 验,当 方 差 不 齐 时 采 用D u n n e t t s-t检验。P0.0 5为差异有统计学意义。3 结果3.1 原位瘤瘤重、瘤重抑制率、肺结节计数评分及肺转移抑制率比较 与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组原位瘤瘤重及肺结节计数评分均较低,差异均有统计学意义(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组原位瘤瘤重及肺结节计数评分均低于扶正抑瘤汤低剂量组,差异均有统计学意义(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组瘤重抑制率及肺转移抑制率均高于扶正抑瘤汤低剂量组。见表1。表1 各组卵巢癌肺转移模型裸鼠原位瘤瘤重、瘤重抑制率、肺结节计数评分及肺转移抑制率比较组别原位瘤瘤重(g,xs)瘤重抑制率(%)肺结节计数评分(分,xs)肺转移抑制率(%)模型组 2.3 80.1 6-3 9.0 11.7 0-扶正抑瘤汤低剂量组1.6 60.1 52 6.4 03 2.2 92.9 51 7.2 2扶正抑瘤汤高剂量组1.2 70.0 94 7.6 22 7.4 50.5 72 9.6 3注:与模型组比较,P0.0 5;与扶正抑瘤汤低剂量组比较,P0.0 5。3.2 免疫组化结果比较 肿瘤微血管密度检测以血管内皮细胞标记因子C D3 4为指标进行免疫组化。与正常对照组比较,模型组微血管密度增加,差异有统计学意义(P0.0 5)。与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组微血管密度均减少,差异均有统计学意义(P0.0 5)。见表2。扫描标题处二维码查看图1。表2 各组卵巢癌肺转移模型裸鼠免疫组化结果比较(xs)组别微血管密度正常对照组0.2 4 150.0 0 94模型组0.3 5 170.0 1 66扶正抑瘤汤低剂量组0.2 7 730.0 1 03扶正抑瘤汤高剂量组0.2 6 530.0 0 76注:与正常对照组比较,P0.0 5;与模型组比较,P0.0 5。3.3 E G F R、V E G F及K D R表达水平比较 与正常对照组比较,模型组E G F R、V E G F及K D R表达水平均升高,差异均有统计学意义(P0.0 5)。与模型组比较,扶正抑瘤汤低剂量组与扶正抑瘤汤高剂量组E G F R、V E G F及K D R表达水平均降低,差异均有统计学意义(P0.0 5)。扶正抑瘤汤高剂量组E G F R、V E G F及K D R表达水平低于扶正抑瘤汤低剂量组,差异均有统计学意义(P0.0 5)。见图2。注:1.与正常对照组比较,P0.0 5;与模型组比较,P0.0 5;与扶正抑瘤汤低剂量组比较,P0.0 5。2.E G F R,表皮生长因子受体;V E G F,血管内皮生长因子;K D R,激酶插入区受体,也称血管内皮生长因子受体-2。图2 各组卵巢癌肺转移模型裸鼠3种蛋白表达水平比较4 讨论卵巢癌是全球常见的成年女性恶性肿瘤之一,发病率、死亡率均较高,现已成为世界性的女性公共健康问题8。虽然卵巢癌的治疗手段多样,预后较以往有较大改善,但复发率较高,远处转移依旧是临床常见问题,其中包括肺转移,而且早期不易被发现9。目前,西医治疗卵巢癌以手术为主,以化疗及维持治疗为辅,但药 物 耐 药 性 及 化 疗 所 致 的 不 良 反 应 等 问 题 较多1 0-1 2。研究发现,V E G F、促血管生成素-2等血管新生因子在卵巢癌的发生、发展中起到重要作用1 3。卵28 中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4巢癌属“积聚”“疲聚”“石痕”“肠蕈”等中医范畴,致病因素为湿热、痰、瘀、毒邪,其中瘀血为主要的病理因素。卵巢癌病位虽在卵巢,但也与冲、任脉及肝、脾、肾经密切相关,晚期以虚为主,日久产生腹水,为虚实夹杂之 证,治 以 活 血 化 瘀、利 水 导 湿、扶 正 祛 邪 为 疗法1 4。方剂扶正抑瘤汤以扶正祛邪为主要功效。已有研究表明,扶正抑瘤汤能够协同I N F-基因转染的骨髓间充质干细胞发挥抗肿瘤作用,其作用机制可能与血 清I N F-、B a x/B c l-2途 径 诱 导 的 细 胞 凋 亡 有关6。然而,扶正抑瘤汤在卵巢癌中的作用机制还不清楚。S KVO 3能产生一种高转移性实体瘤,可自发转移到肺部,这与高转移性人类卵巢癌非常相似1 5-1 6。本实验中,采用S KVO 3建立卵巢癌肺转移性裸鼠模型,研究扶正抑瘤汤对卵巢癌肺转移性裸鼠血管新生和肺转移的影响。微血管密度计数是检查肿瘤血管新生的标准,其计数越大,患者病灶转移的概率越高,预后越差,卵巢癌病灶血管新生促进了癌细胞的增殖及侵袭,加速病情恶化1 7-1 8。研究表明,卵巢癌的发展及预后与肿瘤微血管密度具有显著的相关性1 9。本研究结果显示,扶正抑瘤汤有效降低肺转移性卵巢癌的微血管密度。E G F R是一种酪氨酸激酶跨膜受体蛋白,可促进卵巢癌细胞增殖、侵袭转移与抑制细胞凋亡2 0。研究表明,E G F R与 乳 腺 癌 的 不 良 预 后 有 一 定 的 相 关性2 1。女贞子多糖可能通过抑制E G F R/MA P K信号通路,进而抑制HO 8 9 1 0细胞增殖,促进细胞凋亡2 2。V E G F是重要的肿瘤血管新生促进因子,通过与内皮细胞上的受体结合,直接刺激内皮细胞的分裂和增殖,从而促进血管形成,导致肿瘤侵袭转移。V E G F在卵巢癌组织中表达水平较高,且表达水平与分化程度、F i g o分期、浸润深度及淋巴结转移关系密切,或可作为临床治疗新的靶点2 3。K D R是主要介导V E G F促有丝分 裂、血 管 新 生 和 血 管 通 透 性 增 加 效 应 的 受体2 4。V E G F与受体K D R结合,引起一系列的信号转导,释放多种细胞因子与生长因子,刺激内皮细胞的分裂、增殖和迁移,增加微血管通透性,促进肿瘤血管的生成在肿瘤的生长和转移中起重要作用2 4。本研究中,扶正抑瘤汤有效抑制E G F R、V E G F和K D R表达,从而抑制卵巢癌的血管生成和肺转移。本研究结果发现,扶正抑瘤汤对卵巢癌新生血管及肺转移的干预行之有效,在未来的临床治疗中有着非常好的应用前景。参考文献1KAN Z AK IR,OKAM IJ,T AKAM IK,e ta l.O u t c o m e so fs u r g i c a lr e s e c t i o nf o rp u l m o n a r y m e t a s t 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p i t h e l i a l o v a r i a nc a r c i n o m ap a t i e n t sJ.A s i a nP a c JC a n c e rP r e v,2 0 2 2,2 3(1 2):4 2 1 3-4 2 2 5.2 2 袁小波,唐静.女贞子多糖通过E G F R/MA P K信号通路对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响J.环球中医药,2 0 2 2,1 5(1 2):2 3 7 5-2 3 8 0.2 3 杨红耀,郭哲,张欣贺.F A P-和V E G F在卵巢癌组织中的表达及意义J.实用癌症杂志,2 0 2 3,3 8(3):3 9 4-3 9 7.2 4 曹宁川,杨娜.V E G F、K D R在卵巢癌组织中的表达及其与MV D的关系J.中国民康医学,2 0 1 3,2 5(1 1):4 1-4 2.(收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 3)(上接第3 5页)按语:患者初诊时上腹隐痛或刺痛,喜温,纳差,恶心,口苦,舌红,苔黄腻,胃镜提示C AG伴有轻度肠化,肠镜提示回肠溃疡,可知患者有虚实之证,虚乃脾胃气阴两虚,实则为湿热瘀互结于胃肠。李廷荃教授把握患者的整体状况后,祛邪与扶正兼顾,以祛肠中湿热瘀为主,药用马齿苋、蒲公英、苍术、浙贝母、牡丹皮、丹参、当归,同时注重健脾益气养阴,药用四君子汤加黄芪、生地黄、焦三仙。二诊时,患者腹痛减,苔由黄腻转为白黄腻,考虑肠内湿热瘀邪已十去七八,以黄芪、党参、苍术、厚朴、焦三仙等健脾厚肠为主,以三七粉、延胡索和血止痛愈疡,以丹参、九香虫、浙贝母、蒲公英、牡丹皮等活血行气,清热解毒,凉血散结,从而修复胃黏膜,改善肠化。三诊时,患者复查胃镜未见肠化,肠镜未见明显异常。恐余邪未尽,停药后症状复发,以黄芪建中汤合用乌贝散加减以温中健脾、理气和络,调理巩固。后随访得知,患者上腹隐痛消失。5 小结李廷荃教授在“致中和”思想指导下,临床上在治疗C AG时肝、脾、胃三脏兼顾,寒热、虚实、气血同调,邪正兼顾,取得了较好的效果。其在治疗该病时常嘱患者调整生活习惯,先其所因而伏其所主,才能从根本上治疗该病。参考文献1 陈文隆,唐梅文,周玲,等.中医治疗慢性萎缩性胃炎的研究进展J.大众科技,2 0 2 3,2 5(4):9 2-9 5.2 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