第4章I DNA的复制.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Chapter 4 DNA replication,Key notes,Semi-conservative mechanism,Replicons,origins and termini,Semi-discontinuous replication,RNA priming,Basic characters of DNA replication(,基本特征）,The enzyme of DNA replication,（酶学）,The process of DNA replication,（过程）,Reverse transcription,（反转录）,DNA,复制的基本特征,Template,四种,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,为前体，二价金属离子,Mg2+(,或,Mn2+),，按照碱基互补配对规则复制产生子链,解链,复制方式为半保留复制（,semi-conservative replication,）,需要引物（,primer,）,复制方向总是,5-3,复制子,（,replicon,),复制的方向：一般为双向,半不连续性：冈崎片断,(Okazaki fragment),具有高度的忠实性,图,4-1 DNA,复制可能的三种方式以及,Meselson,和,Stahl,实验的可能结果,半保留复制,1958,年，,Meselson,和,Stahl,首次用实验证实了,DNA,的半保留复制。,用普通培养基（,14,N,）,培养,15,N,标记的大肠杆菌。用,CsCl,密度梯度离心法分析,DNA,。,抽提子一代,DNA,分子。,图,4-2,Meselson,和,Stahl,实验的实际结果,Herbert Taylor,在植物根尖细胞中使用放射自显影证明，真核细胞,DNA,的复制方式也是半保留。,复制子（,replicon,),复制子,:,基因组中能单独进行复制的单位。,每个起始点到终止点的区域为一个复制子。,起始点（,origin of replication,ori,):,原核生物,DNA,分子中只有一个，长度,200bp,左右。大肠杆菌,ori,C,有,245,bp,。,真核生物有多个复制起始点。,三个特征：,a,）由多个短的重复序列组成；,b),富含,AT,；,c),能够被特定的复制起始区结合蛋白识别。,终点（,ter,）,：通常不固定。,图,4-3,证明,DNA,复制的方向始终是,53,的末端终止实验,图,4-10 DNA,的半不连续复制,Okazaki fragment,Leading strand,Lagging strand,DNA,复制所需要酶和蛋白质,DNA,polymerase(DNA,pol,),DNA,解链酶,(,helicase,),：,：,水解,ATP,获能解开双链,DNA,单链结合蛋白,(single-stranded binding protein,SSB),DNA,引发酶,(,primase,),：,RNA,引物合成,DNA,拓扑异构酶,(,topoisomerase,),：,与超螺旋松驰有关，改变,DNA,拓扑性质，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进，有,型和,型，原核、真核中均有。,DNA,连接酶,(,ligase,),端粒酶,(telomerase),原核生物,DNA,聚合酶（,DNA,polymerase,DNA,pol,),1957,年,Kornberg,首先从大肠杆菌提取,DNA,pol,：,聚合作用,：,5 3,3 5,外切酶活性,：校对功能,5 3,外切酶活性,：引物切除、损伤修复,主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及,DNA,损伤的修复,DNA,pol,I,具有的聚合酶和,5-,外切酶活性的配合使用可导致本来一条链带有切口的,DNA,分子发生,切口平移,(nick translation),。,目前已在,E.coli,中发现,DNA,pol,、,、,、,和,。,DNA,polI,催化的缺口平移,DNA,pol,是,单一肽链的大分子,由,pol,A,编码,，,分子量为,109kD,二级结构以,-,螺旋为主。,用特异的蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶,subtilisin,或胰蛋白酶,trpsin,）处理，可把,DNA,pol,水解为两个片段。,小片段：,323,个氨基酸残基，,5 3,外切酶活性,大片段或称,Klenow,片段,：,605,个氨基酸残基，,DNA,聚合酶活性和,3 5,外切酶活性,图,4-13 DNA,pol,的聚合和校对,finger,thumb,palm,DNA,pol,：,5 3,聚合酶活性及,3 5,外切核酸酶活性，,90kDa,，由,pol,B,基因编码。,DNA,pol,:,由,10,个亚基组成，分别为,、,、,、,、,、,、,、,、,及,。,是原核生物体内真正起复制作用的酶，主要有核心酶和全酶两种形式。,全酶由,核心酶,、,滑动钳,(sliding clamp),和,钳载复合物,(clamp-loading complex),组成。,核心酶：由,、,、,组成。,亚基：由,pol,C,(,也称,dna,E,),基因编码，,5 3,聚合酶活性,亚基,:,由,dna,Q,基因编码，,3 5,外切酶,校对和编辑,为装配必须,Pol,III,：由核心酶和,亚基组成。体内,Pol,III,形成二聚体，分别负责前导链和后随链的复制。,钳载复合物：由,、,、,、,及,亚基组成，具有,ATP,酶活性，负责,滑动钳的装载。,滑动钳：由两个,亚基组成，为环绕,DNA,模板而成的环状六角星结构。,图,4-14,E.coli,DNA,polIII,全酶的结构模型,DNA,pol,和,1999,年被发现，属于易错的聚合酶，参与,DNA,的修复合成。,DNA,pol,与,DNA,pol,II,在细菌生长的稳定期被诱导表达，一起修复该阶段,DNA,损伤,DNA,pol,在细菌进行,SOS,反应时被诱导合成。由,1,个,Umu,C,和,2,个,Umu,D,组成。,真核生物,DNA,聚合酶,目前发现超过,15,种，最重要的是,、,、,、,和,五种。,、,、,及,四种，都有,5 3,聚合功能。,及,、,参与核染色体,DNA,复制；,：,链合成的引发，,和,：链的延长，具,3-,外切酶活性，校对功能。,PCNA(proliferating,cell nuclear antigen),为,的辅助蛋白，三个亚基组成滑动钳，以提高,的进行性。,：两个结构域，,N-,端为,5-,脱氧核糖磷酸酶和与单链,DNA,结合的活性；,C-,端具聚合酶活性。参与,DNA,损伤的修复，增补,DNA,链上短的空隙。,：,线粒体,DNA,复制和损伤修复，具聚合酶、,3-,外切酶和,5-,脱氧核糖磷酸酶活性。,端粒与端粒酶,(telomerase),Telomere:,真核生物线性染色体,3-,末端的一种特殊结构，由蛋白质和,DNA,组成。核苷酸重复序列富含,G,，,和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的,DNA,端粒含有,TTAGGG,重复序列，长度,515kb,。,作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解以及不正常的融合和重组；解决染色体复制时末端丢失问题。,Telomerase:,由,RNA,和蛋白质组成的酶。兼有模板和逆转录酶两方面的作用。,1995,年，,Feng,等克隆了,人类端粒酶,RNA,基因，长约,450,个碱基的,RNA,序列中有一段长,11,个核苷酸的区域（,5-CUAACCCUAAC-3,）,与人的端粒序列（,TTAGGG,）,n,互补。,端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽成分,p80,和,p95,。,图,4-27,端粒酶的作用机理,端粒与衰老,实验,：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。,结论,：细胞的衰老是由端粒驱动的。,体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。,可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟 或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。,胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在，而体细胞则很难检测到端粒酶的活性，端粒的长度也短得多。,端粒酶与肿瘤,人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。,体细胞的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而肿瘤端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。,端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。,端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。,可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。,人端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcription),：具有肿瘤特异性，因此,hTERT,启动子可以用于靶向治疗基因的表达。,Figure 1,Schematic diagram of,adeno,-associated virus(AAV).(a)The,structure of the wild-type AAV.(b)The,gene-delivery vector based on AAV.The viral genome is replaced by an,expression cassette,which usually consists of a promoter,transgene,and,polyA,(,pA,)tail.(c)Diagram of AAV-,hTERT-hIFN-,.(d)Diagram of the,two ORF,rep,and,cap,.Cap encodes three,capsid,proteins,VP1,VP2,and,VP3,.The arrows mark sites of the specific,ligands,insertion(numbers are,the amino acid positions N-terminal of the insertion).,Chin,Sci,Bulletin,2007,52:1590-1599.,Oncogene,(2004)23,457-464,DNA,的复制的过程,DNA,复制过程的三个阶段,DNA,复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。,DNA,链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除,RNA,引物后填补空缺及连接冈崎片段。,DNA,复制的终止阶段。,（一）,DNA,复制的起始阶段,复制是从,DNA,分子上的特定部位开始的，即复制起始点,(origin of replication),常用,ori,或,o,表示，复制的基本单位为复制子或复制单元,(,replicon,),。,在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。,在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。,DNA,复制起始点的结构特性,大肠杆菌,Ori,由,422,个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构,(palindrome),。,有些生物复制起始点,Ori,是富含,AT,的区段。这些特殊的结构对于在,DNA,复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。,图,4-28,E.coli,的,OriC,结构,(,一,)DNA,复制的起始,E.Coli,DNA,复制起始包括对其复制起始区,OriC,的识别，以及引发体,(,primosome,),的形成。,DNA,双螺旋的解旋由多种酶来完成的,DNA,解链酶：水解,ATP,获能解开双链,DNA,单链结合蛋白（,SSB,蛋白）：保持单链结构,引发酶,(RNA,聚合酶,),：合成,RNA,引物,随从链是由引发体来完成的,图,4-29,E.coli,DNA,复制过程中引发体的形成,（二）,DNA,链的延长,复制的延伸在复制体,(,replisome,),内进行。,DNA,的复制实际上就是以,DNA,为模板在,DNA,聚合酶作用下，将四种,dNTP,聚合成,DNA,的过程。,过程：复制体的形成,前导链合成,后随链合成,后随链合成与前导链合成之间的协调。,图,4-30,E.coli,DNA,复制过程中复制体的形成,图,4-31,E.coli,DNA,复制的延伸,（三）,DNA,复制的终止阶段,E.coli,DNA,具有复制终止位点,Ter,位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做,Tus(terminator,utilization substance),，通过阻止,Dna,B,解链酶,(,Helicase,),的解链活性而终止复制。,图,4-32,E.coli,DNA,复制终止区的结构,其它环状,DNA,分子的复制,1,、,复制,:,首先由,J.,Carins,从大肠杆菌中观察到,又称为,Carins,复制。,2,、滚环复制（,rolling circle replication),：噬菌体,(,X174,和,M13),和一些小质粒；真核生物如两栖卵母细胞的,rDNA,和哺乳动物的,DHFR(,二氢叶酸还原酶,),基因。,3,、,D,环复制（,D loop replication),：,线粒体和叶绿体,DNA,和少数病毒如腺病毒,DNA,的复制,滚环复制,D,环复制图,真核与原核生物,DNA,复制的特点,(,差别,),染色质和核小体结构对,DNA,复制的影响,复制叉移动的速度远远低于原核细胞,真核生物是多点复制，具多个复制起始区，原核生物是单点复制。,冈崎片段的长度短于原核细胞,复制严格限制在细胞周期的,S,期,真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上,DNA,的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的,DNA,复制。,真核生物线性,DNA,末端具有端粒结构。,逆转录（,reverse transcription),逆转录：以,RNA,为模板合成,DNA,，存在于逆转录病毒以及原核生物和真核生物如端粒酶的延长等。,逆转录酶（,reverse transcription),逆转录病毒的基因组复制过程,乙肝病毒基因组的复制,图,4-40,（,1,）逆转录病毒的结构,图,4-40,（,2,）逆转录病毒的详细结构,图,4-41,逆转录病毒基因组的结构,图,4-42 HIV,的生活史,图,4-43 HIV,与宿主细胞的附着,图,4-44,逆转录病毒基因组逆转录的详细过程,图,4-45,逆转录病毒基因组的逆转录结果,图,4-46,原病毒,DNA,进入细胞核的机理,逆转录酶（,reverse transcription),1964,年，,Temin,发现,Rous,肉瘤病毒等,RNA,病毒所造成的感染可被,DNA,合成抑制剂遏制。,表明,：,RNA,肿瘤病毒的,RNA,复制过程中要合成,DNA,。,Temin,又发现放线菌素,D,能抑制致癌,RNA,病毒的复制，但不能抑制一般,RNA,病毒的复制。,表明：转录对于,RNA,病毒增殖是必需的。,Temin,提出前病毒假说：原病毒,DNA,是,RNA,肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。,1970,年，,Temin,在,Rouse,肉瘤病毒、,Baltimore,在白血病病毒中发现逆转录酶。,逆转录酶是一种多功能酶：,1,、,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性,2,、,RNA,酶,H,（,RNaseH,）,活性：水解,RNA-DNA,杂交体上的,RNA,3,、,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性：合成互补,DNA,。,4,、,没有,35,外切酶活性。,特点：,含有,Zn,2+,DNA,合成反应要求有模板和引物。,需适当浓度的二价阳离子（,Mg,2+,、,Mn,2+,）,5 3,乙肝病毒基因组,的复制,其复制需通过逆转录过程经,RNA,中间体实现，其,DNA,聚合酶也是一种逆转录酶。,逆转录病毒：,RNA DNA RNA,乙肝病毒：,DNARNA DNA,实验室,cDNA,的合成,-,特定基因的获得,常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的,mRNA,，经,逆转录生成的,cDNA,可代表某一特定基因。,常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为,AMV-RT,；,来自鼠白血病毒称为,MMLV-RT,。,Topic,1 cell cycle,2 apoptosis,3 micro RNA,4 transcription,5 translation,6 telomerase,