免疫固定电泳技术创新.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫电泳,(Yong),技术,第一页，共四十一页。,一、免疫电泳技术的发展,二、免疫电泳技术的相关概念,三、介绍几种经典的免疫电泳技术（重点,(Dian),）,四、凝胶免疫电泳技术要点,五、免疫增殖性疾病及免疫检测,本,(Ben),课内容,第二页，共四十一页。,免疫电泳技,(Ji),术,1953,年,Grabar,和,Williams,将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固,(Gu),定电泳等新方法。,一、免疫电泳技术的发展,第三页，共四十一页。,琼脂电泳,与,免疫扩散沉淀技术,相结合的,(De),一门技术。,(K),1,电泳优点,（,1,）将蛋白电泳分开,（,2,）加快反应速度,2,沉淀反应,（一）免疫电泳技,(Ji),术的定义,二、免疫电泳技术的相关概念,免疫电泳,分析,immunoelectrophoresis,第四页，共四十一页。,蛋白质具有可解离的酸性,(Xing),和碱性,(Xing),基团，在一定,PH,值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率不同而分为不同的区带。,（二）电泳的基本原理及,(Ji),其影响因素,I,基本原理,电泳（,electrophoresis,）,:,带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。,第五页，共四十一页。,1.,颗粒（蛋白）本身特性,：,两性、大小、形状,2.,载,(Zai),体性质,：,最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶,3.,电场强度,4.,溶液,PH,值及离子强度,缓冲液的作用,最适电泳缓冲液,0.05M,，,PH8.6,巴比妥缓冲液,II.,电泳的,(De),影响因素,第六页，共四十一页。,5.,电渗,（主要与载体特性有关）,电渗定义,电渗方向与电泳方向的关系,J,电泳迁移率：,指在同,(Tong),一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。,6.,电源,第七页，共四十一页。,定 义：,区带电泳,+,免疫双扩散,(K),基本原理：,在电场作用下，将,(Jiang),标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应抗血清，抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀线。,1.,免疫电,(Dian),泳,三、介绍几种经典的免疫电泳技术,第八页，共四十一页。,免疫电泳,将蛋白质抗原在琼,(Qiong),脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分离。,撤去电压，在与电泳方向平行的琼脂打槽并加入相应抗体进行双向免,(Mian),疫分散。,分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。,据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，,即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。,(K),第九页，共四十一页。,免疫,(Yi),电泳操作步骤：,第十页，共四十一页。,结果复杂,(,经验判,(Pan),断,),可不生成沉淀线（浓度太高或太低），或沉淀线重合,技,(Ji),术评价：,第十一页，共四十一页。,（,1,）,Ig,量及单克隆性与沉淀线致密度关系,（,2,）,Ig,量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最,(Zui),适比关系,结,(Jie),查分析（,K,）,第十二页，共四十一页。,血清蛋白,(Bai),的分析，如多发性骨髓瘤、,r,球蛋白缺乏症,应,(Ying),用：,第十三页，共四十一页。,2.,对流免疫电,(Dian),泳,定义：,定向加速度,(Du),的免疫双扩散技术（,K,）,对流免疫电泳示意图,在,pH8.0,的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体,Ig,由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。,电渗：,指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。,第十四页，共四十一页。,出现沉淀线,洗涤、染色、分,(Fen),析结果,对流免疫电泳操作,(Zuo),步骤：,制琼脂板,打孔,加样,电泳,Ab,Ag,第十五页，共四十一页。,高电渗,为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移动,（,K,）,对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高,抗原、抗体比例要求严格,抗原或抗体,PI,相近或迁移率非常接近，不宜,(Yi),做对流免疫电泳,技,(Ji),术评价：,第十六页，共四十一页。,可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的,(De),测定，但近年多以,ELISA,替代。,应,(Ying),用：,第十七页，共四十一页。,定义：,加速度的单向,(Xiang),扩散,（,J,）,3.,火,(Huo),箭,免疫电泳,火箭免疫电泳示意图,标准曲线,测定样本,含有抗体的琼指,基本原理：,琼脂凝胶中的,抗体不发生移动,(K),，样品孔中的抗原向正极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。,第十八页，共四十一页。,制备,含抗体的琼脂板,(K),打孔,加样,电泳,出现火箭形沉淀,(Dian),线,洗涤、染色、分析结果,火箭免疫电泳操,(Cao),作步骤：,第十九页，共四十一页。,“,峰高,浓度标准,”,曲线,：,以不同,(Tong),稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。,唯一的定量方法,（,K,）,火箭免疫,(Yi),电泳的定量测定,第二十页，共四十一页。,l,电渗小,2,电泳终点时间较难掌握,3,开启小电流后再加样，否则形成宽底峰,4,IgG,电泳应先将其甲酰化,(Hua),，使只带负电荷,火箭电泳操作时应注,(Zhu),意以下几点：,第二十一页，共四十一页。,PH 8.6,时，分析蛋白质抗原带有负电,(Dian),荷,免球测定应先甲酰化，以增加其净负电荷量,技,(Ji),术评价：,第二十二页，共四十一页。,大多数蛋白质均可用这一方法,(Fa),进行测定，但目前已被敏感度高，特异性好的,ELISA,等方法代替。,应,(Ying),用：,第二十三页，共四十一页。,基本,(Ben),原理：,将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合而固定的某种蛋白,。,5.,免,(Mian),疫固定电泳,(K),（,immunofixation electrophoresis,。,IFE,）,（,IgA,型,MM,）,第二十四页，共四十一页。,海伦娜免,(Mian),疫固定仪,第二十五页，共四十一页。,免疫固定电泳最常用于,M,蛋白的鉴定。,鉴定方法：先将患,(Huan),者血清在琼脂上等作区带电泳，之后，加抗血清，依次加抗,IgG,、抗,IgA,、抗,IgM,、抗,K,轻链和抗,L,轻链。必要时还可加抗,Fab,、抗,Fc,等特殊抗血清，作用后，洗涤，染色后分析固定的,M,蛋白成分。,该方法可用于各种蛋白水平的定性检测。,应,(Ying),用：,第二十六页，共四十一页。,1,电泳载体的,(De),选择,与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。,2,凝胶打孔及处理,用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封底，以免样品渗漏。,四、凝胶免疫电泳的技术,(Shu),要点,第二十七页，共四十一页。,3,加样,加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过多自由扩散。,4,选择抗原与抗体比例,适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物，选择抗原和抗体的比例尽量减少前,(Qian),后带现象的发生。,第二十八页，共四十一页。,5,检测方法,如果沉,(Chen),淀线理想，通过肉眼观察即可定性。,在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高检测的敏感度。,(1),染色,(2),光密度测定法,(3),放射性自显影,第二十九页，共四十一页。,6,干燥与保存,（,1,）除盐及游离蛋白质后，干燥,（,2,）保存 将染色片浸泡在,5,l0,甘,(Gan),油中,30min,，保存效果更好。,第三十页，共四十一页。,五、免疫增殖性疾病及免疫检,(Jian),测,(,重点：,临床和检验特点,),免疫增殖病,淋巴细胞,(Bao),异常增殖,免疫球蛋白异常增生性疾病,（浆细胞异常增殖）,良性增殖：,常,多克隆增殖,恶性增殖：,常单克隆增殖,第三十一页，共四十一页。,免疫球蛋白恶性增,(Zeng),生性疾病的免疫损伤,1.,免疫球蛋白合成异,(Yi),常,血液粘稠增加,2.,正常体液免疫抑制,3.,免疫球蛋白或其片段可以沉积于组织，激活细胞免,疫或补体系统,造成器官损伤,4.,浆细胞瘤的浸润性生长,溶骨性病变,第三十二页，共四十一页。,多发,(Fa),性骨髓瘤（,MM,）,特,(Te),点,I.,介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病,贫血,肾功损害,免疫功能障碍,骨痛,高粘血症,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量明显降低,血,M,蛋白或尿本周蛋白,骨髓发现大量浆细胞,溶骨性损害,第三十三页，共四十一页。,检测方法,(Fa),：火箭和对流用于检测有无抗体，检测,MM,效果不好,（,K,）,1.,血清蛋白,(Bai),电泳,M,蛋白,2.,尿本周氏蛋白检测,3.,免疫检测方法,免疫电泳,免疫固定电泳,免疫球蛋白及轻、重链定量,第三十四页，共四十一页。,免疫固定,(Ding),电泳,免,(Mian),疫电泳,免疫球蛋白定量,第三十五页，共四十一页。,巨,(Ju),球蛋白血症,特,(Te),点,好发于老年男性,血粘滞过高综合征,临床特点,检查特点,其它免疫球蛋白常在正常范围,血,IgM,蛋白,淋巴结、肝和脾肿大,第三十六页，共四十一页。,重链病：,重链的不同,(Tong),可分为,型,、,型,、,型,特,(Te),点,贫血,细菌感染,淋巴结肿大,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量可降低,重链,第三十七页，共四十一页。,轻链病：,型,、,型（此,(Ci),型预后差）,特,(Te),点,发热,肾功能损害,临床特点,检查特点,免疫球蛋白水平可降低或正常,轻链,贫血,溶骨性损害,第三十八页，共四十一页。,良性,(Xing),单克隆免疫球蛋白增殖病,特,(Te),点,无明显临床症状,临床特点：,检查特点,其它免疫球蛋白常在正常范围,有,M,蛋白，但其并不呈进行性增加,第三十九页，共四十一页。,小,(Xiao),结,免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳的,(De),定义、原理及技术要点,几种免疫增殖性疾病的临床特点和检验特点,第四十页，共四十一页。,内容,(Rong),总结,免疫电泳技术。电泳（electrophoresis）:带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。2.载体性质：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶。4.溶液PH值及离子强度缓冲液的作用。最适电泳缓冲液0.05M，PH8.6 巴比妥缓冲液。电渗方向与电泳方向的关系。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。（2）Ig量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最适比关系。血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、r 球蛋白缺乏症。高电渗为特点，但电渗过强会使,(Shi),蛋白质向阴极移动（K）。与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。恶性增殖：常单克隆增殖。血M蛋白或尿本周蛋白。检测方法：火箭和对流用于检测有无抗体，检测MM效果不好（K）。1.血清蛋白电泳M蛋白。重链。小结,第四十一页，共四十一页。,