非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:山东省重点研发计划项目()山东省现代农业产业技术体系()山东省农业科学院农业科技创新工程项目()泰山学者工程项目作者简介:矫健()男山东青岛人硕士研究生主要从事动物病毒学与免疫学研究:.李建达()男山东济南人博士主要从事动物微生物与免疫学研究:.同为第一作者通信作者:于江()女山东莱州人博士研究员研究方向为动物病原学与免疫学:.吴家强()男山东诸城人博士研究员研究方向为动物病原学与免疫学:.非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定矫健李建达韩先杰张琳张玉玉任素芳刘飞陈智 张文娟于江吴家强(.青岛农业大学动物医学院山东 青岛.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室山东 济南.山东碧蓝生物科技有限公司山东 泰安)摘要:非洲猪瘟()是由非洲猪瘟病毒()引起的一种高度传染性病毒性疾病发病率和死亡率高达 对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击 蛋白为 的结构蛋白本研究构建了重组原核表达质粒 将其转化至大肠杆菌()感受态细胞表达重组 蛋白并纯化经 鉴定证实重组 蛋白与 阳性血清有良好的免疫反应性 利用重组 蛋白免疫/小鼠并通过间接 方法筛选到 株能够稳定分泌 蛋白单克隆抗体()的杂交瘤细胞株 和 经抗体亚型鉴定两株抗体均为 型经 鉴定两株抗体能够特异性识别过表达的 蛋白 综上本研究成功表达并纯化了 重组蛋白制备了 单克隆抗体为进一步探讨 蛋白的结构功能及其在 中的感染致病机制提供了基础条件关键词:非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体原核表达中图分类号:.文献标识号:文章编号:()(./.)()().()./().非洲猪瘟()是由非洲猪瘟病毒()引起的一种高度传染性、出血性疾病临床上以高热、皮肤发绀、淋巴结及脏器广泛出血为主要特征如肾瘀斑、皮肤红斑、肺水肿、弥散性血管内凝血等 主要通过接触性传播家猪和野猪都是其主要宿主一旦侵入家猪便可在猪群中快速传播发病率和死亡率高达 感染性病毒在组织中能够存在较长时间尤其是淋巴结和扁桃体 此外该病毒也是唯一已知的 虫媒病毒能够通过软蜱进行传播 于 年首次在肯尼亚报道随后传入其他非洲国家 年在格鲁吉亚发现了毒力更高的 型并迅速传播 年 月我国沈阳首次暴发 随后迅速蔓延到全国所有省份对我国乃至全世界的养猪业造成了严重的经济损失 是 科中 属的唯一成员是一种有囊膜的双链 病毒 粒子是具有多层结构的二十面体直径约为 病毒粒子结构自内向外依次为类核、核壳、内囊膜、衣壳、外囊膜 基因组长度约为 目前已从其中鉴定出结构蛋白 种部分蛋白的功能尚不清楚 这些结构蛋白分布在不同的区域在病毒黏附与入侵、病毒基因组复制和转录、病毒包装与出芽以及免疫逃避等病毒感染的不同方面发挥着重要的作用 由于 结构复杂繁冗对其功能的了解也十分有限到目前为止还没有完全有效的 商业疫苗因此鉴定病毒结构蛋白的免疫原性在探讨病毒与宿主相互作用中至关重要 蛋白由 基因编码分子量为 最初被描述为一种早期诱导的跨膜结构蛋白位于病毒颗粒外部能够从病毒颗粒表面溶解释放出来 然而进一步的研究发现 蛋白位于病毒颗粒的内膜和感染细胞的表面 目前 蛋白在 感染致病过程中的作用仍不清楚 本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达并纯化出 重组蛋白通过免疫/小鼠成功制备了其单克隆抗体()为进一步探究 蛋白的生物学作用奠定基础 材料与方法.细胞、菌株、载体及实验动物大肠杆菌、()感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司骨髓瘤细胞/、载体均由本实验室保存标准阳性血清购自中国兽医药品监察所 级 周龄/雌性小鼠购自济南朋悦试验动物繁育有限公司.主要试剂质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司限制性核酸内切酶、连接酶、蛋白 均购自赛默飞世尔科技公司 购自德国 公司单抗亚型鉴定试剂盒购自美国 公司 发光液、羊抗鼠、羊抗猪 购自 公司.蛋白的原核表达.重组表达质粒 的构建根据 /株基因序列(.)的 基因序列进行引物设 第 期 矫健等:非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定计正向引物()序列:(包含 酶切位点)反 向 引 物()序 列:(包含 酶切位点)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成 以合成的密码子优化后的 基因序列为模板使用引物扩增目的基因片段 反应程序为 个循环 结束 将扩增产物进行 的琼脂糖凝胶电泳并纯化回收用 连接酶分别将 基因与 载体连接将连接产物转化到感受态细胞 中 挑取单克隆摇菌菌液经 鉴定为阳性后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序 测序成功后将阳性重组质粒命名为.重组蛋白的表达和纯化将阳性重组质粒 转化至大肠杆菌()感受态细胞挑取单克隆至 培养基中 培养过夜取 菌液接种至氨苄青霉素()抗性的 液体培养基中、/摇床培养至 值达到.时添加终浓度为 /的 诱导目的蛋白表达诱导 后收集菌体沉淀使用 裂 解 液(/.)重悬菌体进行超声破碎、/离心经 电泳鉴定后使用.滤膜过滤与蛋白纯化填料 过夜结合 采用亲和层析的方式纯化收集洗脱产物用于 鉴定使用超滤管将有单一目的蛋白条带的洗脱产物浓缩并置换到 中 保存.重组蛋白的 鉴定重组 蛋白纯化后进行 电泳随后转移到 膜上经 脱脂奶粉封闭后以 标准阳性血清()作为一抗孵育 清洗 后 加 入 标 记 的 羊 抗 猪 二 抗()孵育 进行 鉴定.单克隆抗体的制备./小鼠的免疫及血清效价的测定纯化后的重组 蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后对 只 周龄/小鼠进行背部多点皮下注射免疫剂量为 /只每 免疫一次共免疫 次 最后一次免疫 后从小鼠尾静脉取少量血分离血清通过间接 方法检测血清中的抗体效价 将纯化的 重组蛋白以 /的浓度包被到聚苯乙烯 孔反应板(/孔)放置过夜次日用 洗板 次后进行封闭(/孔封闭液)室温放置.用样品稀释液将小鼠血清按 进行倍比稀释洗板 次后加入稀释好的血清并设置空白血清做阴性对照(/孔)室温孵育 洗板 次后加入 标记的鼠二抗(/孔)孵育 洗 板 次 并 拍 干 加 入 (/孔)室温避光显色 加入终止液(/孔)用酶标仪测定 处各孔的吸光值.细胞融合及亚克隆筛选按照标准流程取免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞/融合通过间接 方法检测筛选阳性杂交瘤细胞使用有限稀释法对单克隆阳性孔进行 次亚克隆 筛选出稳定表达 的阳性孔进行扩大培养.腹水制备将阳性杂交瘤细胞扩大培养并注射至/小鼠的腹腔(经弗氏不完全佐剂乳化)后观察小鼠腹部隆起状况并及时抽取腹水 /离心 收集上清 冻存备用.单克隆抗体的鉴定.单克隆抗体效价鉴定将进行不同比例稀释后的腹水作为一抗 标记的羊抗鼠 作为二抗用重组 蛋白建立的间接 方法进行效价的测定(方法同.).单克隆抗体亚型鉴定用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型测定 准备好包被有重组 蛋白的板条(/孔)每个克隆收集 腹水上清分别滴加到 个对应的酶标孔中(/孔)孵育 洗板 次将稀释好的分型二抗抗、的抗体加入 个孔中 孵育 洗板 次加入 显色有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为山 东 农 业 科 学 第 卷该抗体的亚型.鉴定单克隆抗体的免疫原性 纯化的重组 蛋白经 电泳后转移至 膜上使用 脱脂奶粉封闭 洗膜后加入单克隆抗体()孵育过夜清洗后加入 标记的羊抗鼠 二抗孵育 充分清洗后使用 发光液进行曝光观察结果 结果与分析.重组表达质粒 的构建用/引物对优化的 基因进行扩增结果显示 扩增后的 基因片段约为 大小符合预期(图)通过酶切酶连将 扩增产物连接到 质粒中 经测序分析后基因测序结果完全正确.重组 蛋白的表达和纯化 电泳结果显示与未诱导组相比诱导组可见与预期大小一致的 融合蛋白经超声破碎后可溶性分析发现重组 蛋白条带出现在超声后上清中表明重组 蛋白为可溶性表达(图)进一步大量诱导 重组蛋白的表达并与 亲和层析柱结合使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液洗脱蛋白收集洗脱液随后进行 电泳鉴定 结果显示使用高浓度洗脱液时在 处出现单一条带(图)纯化后纯度大于:阴性对照:目的基因 产物图 基因 扩增目的片段.重组 蛋白的 鉴定对重组 蛋白进行 鉴定通过 标签抗体孵育后在 处检测到嵌合 标签的 蛋白而使用 阳性血清孵育后发现重组 蛋白能够与 阳性血清发生特异性结合(图)表明该抗原具有良好免疫原性:.预染蛋白质分子质量标准.诱导组超声破碎后上清超声破碎后沉淀未诱导组:.预染蛋白质分子质量标准.超声破碎后上清.流穿液.、/咪唑洗脱液:、.预染蛋白质分子质量标准.抗体孵育重组 蛋白.阳性猪血清孵育重组 蛋白图 重组 蛋白的表达()、纯化()及鉴定().单克隆抗体的制备及鉴定.血清效价的测定三免 后通过间接 方法检测接种小鼠血清效价测得、号小鼠的血清效价为 、号小鼠的血清效价为 (图)选取、号小鼠进行加强免疫.单克隆抗体效价测定在骨髓瘤细胞和脾细胞融合后进行融合筛选对筛选的阳性孔进行 次亚克隆后经间接 方法检测最终筛选到了两株能够稳定分泌重组 的杂交瘤细胞株通过小鼠腹腔注射两种杂交瘤细胞株制备了小鼠腹水通过间接 方法测定腹水的效价分别为 和 (图)将获得的单克隆抗体命名为 和 第 期 矫健等:非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定图 小鼠血清效价()及单克隆抗体效价()的测定.单克隆抗体亚型鉴定 采用美国 公司的单抗亚型鉴定试剂盒分别对 和 的亚型进行检测结果显示两种 的亚型均为(表)表 单克隆抗体亚型鉴定细胞株编号亚型轻链类型.单克隆抗体的免疫反应鉴定为了鉴定 和 的免疫反应性通过 检测了其对外源性 蛋白的反应性 结果显示两株 均能够在 处与 蛋白发生特异性反应(图):预染蛋白质分子质量标准:重组 蛋白图 单克隆抗体()和()的免疫反应鉴定 讨论与结论自 年 传入中国并迅速传播以来 对生猪生产造成了重大的经济威胁目前在中国传播的 类型主要为一种高毒力的基因型毒株基因型毒株也有报道 在环境中具有高传染性和稳定性可通过与受感染的猪或其产品直接接触或通过软蜱进行传播 直到目前仍然没有针对 的有效商业疫苗使得非洲猪瘟的预防、控制和治疗变得十分艰难因此筛选 免疫原性蛋白鉴定免疫相关基因将有助于 疫苗的开发 另外需要对 的结构功能等基础研究进行攻克以期为 疫苗或诊断试剂的研发提供更多理论依据 相关研究表明鉴定最具抗原性的病毒蛋白对改进血清学诊断试验具有重要作用在 血清诊断试验中使用重组蛋白作为抗原来源可避免操纵活病毒的潜在风险 蛋白为 的结构蛋白根据序列分析比较东欧等地区 分离株中的 序列保守证明 蛋白是抗原稳定的因此适合用作开发新的血清诊断试验的工具 目前对于 蛋白的功能研究尚不完善其生物学功能仍待阐明原核表达系统具有操作简单、表达量高的特点本研究中所用的原核表达载体 可在()细菌中高度表达并且可以在裂解物的上清液中检测到大量目标蛋白大大简化了纯化过程同时避免了由包涵体的变性和复性可能引起的活性损失 虽然从构象结构上看原核表达与真核表达的抗原会有差异但不会影响抗原的线性表位因此使用原核表达系统制备单克隆抗体仍可继续进行线性表位的筛选为 结构功能的研究提供生物学材料单克隆抗体()是诊断病毒感染的关键试剂 与多克隆抗体相比 在现代免疫诊断的应用中表现出特异性强、灵敏度高等优势在疾病预防、诊断、治疗和流行病学调查等研究中发挥了巨大作用 张冯禧等通过原核表达系统获山 东 农 业 科 学 第 卷得 重组蛋白并制备了 效价为 表明该蛋白有良好的免疫原性 齐艳丽等通过原核表达系统表达纯化了 重组蛋白并制备了 抗体 效价均高于 且特异性良好本研究通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化出一种可溶性重组蛋白 并制备了两株针对该蛋白的 经 和 共同分析重组蛋白大小约为 将纯化的重组蛋白做免疫原免疫小鼠得到抗体的 效价不低于 说明制备的 具有良好的免疫原性为 蛋白的结构功能等基础研究以及 免疫类诊断试剂产品的开发提供了重要的生物材料参 考 文 献:.:.王清华 任炜杰 包静月 等.我国首例非洲猪瘟的确诊.中国动物检疫 ():.吴萌萌 张栋良 孙彩虹 等.非洲猪瘟研究进展.畜牧兽医杂志 ():.(/):.():.():.:.():.:.:.():.():.郭怡德 李冰 蔡汝健 等.非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展.动物医学进展 ():.():.:.():.():./.:.():./.():.:.():.():.():.():.于浩洋 王彩霞 吴绍强 等.非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体的制备及阻断 检测方法的建立.中国兽医科学 ():.张冯禧 肖琦 朱家平 等.非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断 方法的建立.中国农业科学 ():.齐艳丽 刘桃雪 于海深 等.非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定.畜牧兽医学报():.第 期 矫健等:非洲猪瘟病毒 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定