微生物限度检查.ppt

,无忧,PPT,整理发,Haga clic para cambiar el estilo de ttulo,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,Haga clic para cambiar el estilo de ttulo,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,无忧,PPT,整理发,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物限度检查法,张翠所,1,第一节 微生物限度检查概述及限度标准,一、微生物限度检查的概念和意义,1,、微生物限度检查的概念,微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。,检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。,2,2,、微生物限度检查的意义,（,1,）药品染菌对使用者的潜在危害,药品中染菌数量愈高，其中所含致病菌的几率愈高，这是造成药源性感染疾病的直接原因。,药品染菌还可使其产生霉变、酸败等理化性质改变造成药品失效、变质，甚至产生毒素，危害使用者的健康。,为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。,3,（,2,）药品染菌反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。,微生物限度检查的各项数据，是对药品生产工艺、生产环境、质量管理及人员素质的综合评价依据之一。,只有优良的,GMP,企业，才能提供优质的医药产品，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率高。,4,二、药品微生物限度检查的特殊性和基本条件,1,、药品微生物限度检查的特殊性,（,1,）活体细胞,（,2,）分布不匀,（,3,）多数处于受损状态,（,4,）生境复杂,5,（,1,）活体细胞,药品微生物限度检查以活体菌细胞为对象，污染菌在药品中处于不稳定状态，可随存放时间延长而死亡，也可在适宜条件下大量繁殖。药品还可因为本身性质，存放温、湿度，暴露空气等状态不一，污染菌发生变化导致检出结果的差异,.,由于检验对象的这种活体特征，保持供检样品污染菌尚存活而又不大量增殖尤为重要。,6,（,2,）分布不匀,药品中微生物特别是在生产企业后期污染者通常是局部的，非均匀的，同一批产品中不同部位、人员操作、包装点的不同瓶（盒、袋）常出现检测结果差异。,为提高检出的阳性率，限度检验的供检样品规定了检验数量。,7,（,3,）多数处于受损状态,药品污染菌自生长过程中受到原料处理、加工、加热以及药物本身的影响，有一定的损伤，受损的细胞在常规的直接培养中，往往不能及时复苏，进入繁殖周期，所得检验结果常是,“,阴性,”,或计数偏低而,“,符合规定,”,的结论。,因此，在检验时须采用一些措施，利于被检菌的恢复从而提高阳性检出率,。,8,（,4,）生境复杂,由于药品的种类繁多，剂型多样，使染菌的生境多样而复杂，在某些药品中大量繁殖，而在另一些药品中不能生长。,药物的,pH,、渗透压、含水量以及污染菌的检查常会出现不同的结果，如一些非水溶性油剂、软膏剂，由于其疏水性致使菌细胞与培养基成分隔离或因缺氧而难以生长。,9,2,、药品微生物限度检查的基本条件,由于污染菌在药品中的不稳定性和诸多影响因素，为真实地反映药品的污染状况，除采用准确可靠的方法和对检验结果的正确判断外，尤须注意以下几项基本条件：,10,1,）使用符合规定的培养基,使用符合规定的培养基是限度检查的最基础保障。而培养基的适用性检查尤为重要，,2010,版药典明确规定，实验用培养基必须经过适用性检查，结果符合规定方可使用。,11,2,）保持供检样品的原污染状态,对供检样品提供原始污染状况的微生物检查数据是限度检查的基本任务。,药品的第二次污染及繁殖或死亡引起的状态改变均不能反应药品的微生物真实质量。,12,3,）按规定抽样检验,由于药品染菌的随机性和不均匀性，欲从小量抽样检验反映整批药品的染菌状况是不可能的。,由于微生物限度检查是破坏性检查，检验一瓶破坏一瓶，增加抽验量及检验数量对提高检出率无疑是有利的，但抽量过多，生产、经营单位难以承受。,因此药典规定了检验量和数量。,13,4,）适宜的供试液制备方法,正确制备供试液是保证检查结果可靠的前提条件，供试液制备的基本要求是，供试品必须均匀分散于供试液中，被检菌应受到必要的保护。,14,5,）验证实验及对照实验,验证的目的主要是考察供检验品中有无抑菌活性物质干扰实验、检验方法和培养条件的可行性。若在确立新药检验方法及当检验条件变更时，如药品的组分、供试液制备方法或培养基变更等可能影响检验结果时，须重新做验证实验。,对一些已确立检验方法的品种，采用可行的供试液制备方法和固定的培养基，在进行常规法时可免去验证实验的繁琐步骤，制作一些必要的对照实验。通常的对照实验有二种，一种是阴性对照，另一种是阳性对照。,15,6,）严格无菌环境及操作,实验操作应在环境洁净度,10000,级和局部洁净,100,级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。,进行限度检查时，操作人员的无菌观念应贯穿全过程，即在检查过程中的每一空间、每一动作、任一器具未经灭菌处理都是带菌的，供检样品或接种物与之接触都会造成污染，即使在洁净室内操作，仍须严格按照无菌程序操作，避免操作不当的污染造成检验结果错误。,16,三、微生物检查的内容和检验方法,制定不同药品微生物限度标准须按其使用要求、制剂类型、原料性质以及生产条件等综合考虑，对各种繁多的药品，各国药典均规定了相应的微生物限度标准，这些标准的要求基本相同，但不一致。我国药典，,根据药品使用的要求，可将微生物限度标准分为两大类：,17,对于规定灭菌的药品，包括注射剂和输液剂，以及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。必须严格无菌，即在规定检验量的供检样品中不得检出活微生物。,对于非规定灭菌药品，包括常用的口服制剂与局部外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许在规定量的样品中，检出一定限量的微生物，但不得检出某些控制菌。通常药品微生物限度检查的检验对象多为此类药物。,此外，与药品质量密切相关的还有辅料、包装材料以及生产环境的检测和医用材料、器械等也都制定了相应的微生物学限度指标。,18,微生物限度检查的内容和检验方法包括：,（,1,）染菌量检查：,测定单位重量（体积或面积）药品中的细菌数、霉菌数和酵母菌数。制备适宜方法的供试液后，可以采用下列三种方式进行检验：,平皿法 系列稀释供试液，分别加入灭菌平皿中，然后倾注琼脂。,涂布法 将系列稀释的供试液分别涂布于已事先备妥的琼脂平板上,薄膜过滤法 将供试液用薄膜过滤，取出滤膜贴于琼脂平板或其它培养基中。,19,（,2,）控制菌检查：,测定单位重量（体积或面积）药品中的粪便污染指示菌和某些特定菌，如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌、螨等在规定量的样品中不得检出或不超过某限度。,对于大肠菌群，采用系列稀释级供试液，分别定量加置规定数量的试管中，经培养后记录出现产酸或产气的管数，按最近似数（,MPN,）对染菌量做出定量估计。,20,对于其它控制菌，通常是将制备好的供试液，按照待检菌的特性取规定量直接接种于培养基或经薄膜过滤法处理后接种于培养基，分别进行增菌、分离培养，在获得单个疑似菌株培养物的基础上作形态学、生化及血清学鉴定。,21,四、检验结果报告及复试,1.,细菌、霉菌及酵母菌数报告及复试,细菌、霉菌及酵母菌数，一般以每,1g,、,lml,或,l0cm,2,菌落形成单位数（,colony forming,nints,cfu,）报告，特殊药品可以最小包装单位报告。,22,供试品的细菌、霉菌及酵母菌数检查中，任何一项不符合该品种项下的规定，应,进行复试,。,我国药典规定，对菌落数测定当一次检查不合格时，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以,三次,检查结果的平均值报告菌数，这是对染菌处在合格边缘数的产品，避免由此引起可能的争议采取的一种界定方法。,23,2.,控制菌报告及复试,大肠菌群的最近似数,MPN,值（,Most probable number,），它是通过概率计算的近似值也并非精确数量，一般以每,1g,或,1ml,应小于多少个报告。,控制菌如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及梭菌的检查结果以每,1g,、,lml,或,l0cm2,为单位报告，沙门氏菌是以,10g,或,10ml,为单位报告。,特殊药品可以最小包装单位报告。,供试品检出控制菌或其他致病菌时，按,一次检出结果为准,，不再复试。,24,3.,微生物限度检查报告,若供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品在该实验条件下,符合规定；,若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品在该实验条件下,不符合规定。,25,五、微生物检查流程举例,不同给药途径的供试品，标准要求不一样，因而需要检查的项目也有所不同，整个试验流程就不同。,下面我们以,化药直肠给药的,栓,剂,为例。,整个实验流程如图,6-1,所示。,26,（,1,）查标准根据样品给药途径，确定检查项目，方法和所用的实验用具和培养基；,（,2,）培养基配制、样品的前处置、实验用具的前处置；,（,3,）供试品的制备；,（,4,）检查各项目：细菌霉菌及酵母菌计数、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查、白色念珠菌检查；,（,5,）将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌检查用培养基分别划线于相应的选择性平板上；,27,（,6,）观察上述划线平板上的菌落是否为疑似菌，如果无菌生长或无疑似菌报告未检出，如果有疑似菌则要经过下一步的确证实验，经实验确认的控制菌，则报告检出；,（,7,）细菌霉菌及酵母菌，按照菌落报告规则计数，如果菌落数小于标准规定数，则直接计数即可；如果计数结果超过了标准规定数，则须进行复试；,（,8,）写实验报告。,28,第二节 前处置及供试液的制备,一、检验样品前处置,样品包装的完整性和样品的有效性关系到检测结果的准确性。完整性要求检测样品的最小包装原始、完好，没有任何破损。有效性要求检测样品编号的唯一性和可追溯性，以及样品内在的微生物能保持其原始数量和原始种类,。,29,1,、样品的接收,检查样品的完整性，核对品名、规格、批号、有效期、生产单位等信息；,加贴样品状态标识（待检、在检、检毕、留样），并逐一登记。,30,2,、样品的储存和保管,(1),应有适宜的样品储存场所存放样品。要根据样品的储存要求进行存放，一般宜储存于阴凉干燥处，需要冷藏的样品应置冰箱冷藏室保存，并严格监控、记录存放环境的温湿度。,(2),样品在传递、检验过程中应妥善保管，在检样品避免损坏、丢失和存放不当，影响检验结果的准确性。,31,3,、样品检验前的处理,(1),去掉样品的外包装，注意唯一性标识要转贴到最小包装上，防止实验时混淆。,(2),样品进入无菌室前，应用适宜的消毒液对其外表进行擦拭消毒处理，并经紫外线照射,30,分钟后进入操作间。,32,二、仪器及用具的处置,仪器、用具使用前，应洗涤干净，吸管、量筒、试管、培养皿等玻璃制品不挂水滴，无残留抗菌物质，并经无菌化处理。,(1),干热灭菌物品：匀浆杯、剪刀、镊子、不锈钢药勺、吸管、量筒、试管、培养皿、研钵等金属、玻璃、陶瓷制品均可在干燥内箱内干热灭菌。通常加热至,160,恒温,2,小时可完全灭菌。,33,(2),高压蒸汽灭菌物品：为最可靠、最广泛使用的灭菌方法之一。凡是耐高温和潮湿的物品如培养基、无菌衣、金属、玻璃器材、陶瓷制品、传染性污物等可用本法灭菌。将需要灭菌的物品于,0.11MPa,121,灭菌,15,分钟后方可使用。,34,三、培养基的处置,（,1,）培养基的配制,一般采用商品脱水培养基，按照使用说明书进行配制，配制培养基时称量要迅速，以免吸潮而影响称量的准确性，同时为避免增加培养基中的金属离子及其他微量化学元素而影响微生物的生长，所用器具应为洁净玻璃器皿，所用溶解用水为去离子水或蒸馏水。,每个容器内，培养基的装量应不超过容器体积的三分之二，以防加热灭菌时培养基污染瓶塞。,35,（,2,）培养基的,pH,值,培养基的,pH,值应符合规定，否则必需,校正。调节培养基,pH,值，使其高于规定值的,0.2,，灭菌后可达到规定的,pH,值，测定时溶液温度应为,20,25,，调节,PH,值可用,1mol/L,氢氧化钠溶液、,1mol/L,盐酸溶液。分装好的培养基应及时密封,必须在配制后,2,小时内进行灭菌处理。,36,（,3,）特殊配制的培养基,硫乙醇酸盐流体培养基，作为厌氧和好氧检查用培养基需要特别注意。培养基应经煮沸后分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基的氧化层,(,粉红色,),不超过培养基深度的,1/2,在供试品接种前，培养基氧化层的颜色不得超过培养基深度的,1/5,，否则须置,100,水浴中加热至粉红色消失,(,不超过,20,分钟,),，迅速冷却。培养基只限加热一次，并防止被污染。,37,（,4,）采用合理的灭菌方式,培养基采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化，透明度降低，琼脂凝固力降低或,pH,改变,因此灭菌应采用验证合格的灭菌程序进行。,38,四、,供试液制备的基本知识,1,、供试品检验量和检验数量,(1),检验量,检验量即一次试验所用的供试品量（,g,、,ml,或,cm2,）。,除另有规定外，一般供试品的检验量为,10g,或,10ml,；膜剂为,100 cm2,；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。,要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加,20g,或,20ml,（其中,10g,或,10ml,用于阳性对照试验）。,39,(2),检验数量,检验时,应从,2,个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于,4,片。,一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的,3,倍量供试品。,40,2,、稀释剂,各剂型及原辅料的供试品，一般均需用稀释剂经稀释后作为供试液，对于液体制剂可以不稀释，直接用原液作为供试液。常用的稀释剂有：,41,(1)0.9%,氯化钠溶液,(2)pH7.0,氯化钠,-,蛋白胨缓冲液,氯化钠胨水缓冲液可调节供试液,pH,至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌的测定，为最常用的稀释剂。可以按供试品的性质加入聚山梨酯,80,的稀释剂对含油性供试品具有助溶作用。,(3)pH6.8,磷酸盐缓冲液 适用于肠溶制剂,(4)pH7.6,磷酸盐缓冲液 供结肠制剂做稀释用,42,3,、供试液制备的基本要求,根据供试品的理化性质及特性，采用经验证的方法制备成均匀的供试液，不得改变污染微生物的数量和种类，其要求如下：,（,1,）供试液的制备，从取样至制备呈均匀的供试液，必须在符合规定的洁净级无菌室内进行，试验的全过程必须严格无菌操作，防止再污染。,43,（,2,）采用,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液作供试品的稀释剂，或根据供试品的理化性质加入经验证的适宜的助溶剂、乳化剂、中和剂、使其成为均匀的溶液、混悬液或乳浊液。,（,3,）含有抑菌成分的供试品，应按其性质减除抑菌活性对试验的干扰并经验证试验。,（,4,）供试品按验证方法制备成供试液后至加入检验用培养基，不得超过,1,小时。,44,五、供试液的制备方法,采用经验证的供试液制备方法，可采用以下,1,种方法，也可多种方法联合应用。,匀浆仪：,利用匀浆仪高速旋转可将固体供试品快速研细，将油性基质的软膏或易吸水的胶囊剂制备成均匀的供试液。该法快捷、高效、均质、效果好，不易造成污染，为药典优选的方法。,研磨法：,利用研钵将固体供试品研细，将油性基质的软膏剂制备成均匀的供试液。本法劳动强度大，费时，开放式研磨，暴露时间长易造成污染。,45,振荡器法：将供试品及稀释剂置入灭菌锥形瓶内，置于振荡器上震荡，使固体供试品分散、均质。本法简便，但对水丸剂等坚硬的供试品效果欠佳，分散期长。,乳化法：适用于非水溶性供试品如以凡士林为基质的供试品的供试液的制备。在供试品中加入适宜的乳化剂、稀释剂，使用乳化剂的种类和数量必须经过验证。,46,萃取法：取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯，使油质溶化，萃取，以水层作为供试液。适用于以凡士林为基质的软膏等供试品。,加灭活剂：根据供试品含抑菌成分的理化性质，加入适宜的灭活剂，以消除其抑菌活性，加入灭菌剂的种类和量必须通过验证。,47,常用制备方法如下：,1.,液体供试品,取供试品,10ml,，加稀释液至,100ml,，混匀，作为,1:10,供试液。,油剂可加入适量的无菌聚山梨酯,80,使供试品分散均匀。,水溶性液体制剂常用混合的供试品原液作为供试液。,48,2.,固体、半固体或黏稠性供试品,取供试品,10g,，加,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液,至,1OOml,，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为,1:10,的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯,80,，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。,49,3.,需要特殊方法制备供试液的供试品,（,1,）非水溶性供试品,方法,1,：称供试品,5g,（或,5ml,），加至含溶化的（温度不超过,45,）,5g,司盘,80,、,3g,单硬脂酸甘油酯、,10g,聚山梨酯,80,无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入,45,的稀释液至,100 ml,，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为,1,：,20,供试液。,50,方法,2,取供试品,10g,，加至含,20ml,无菌十四烷酸异丙酯（必要时可增加用量）的适宜容器中，充分振摇，使供试品溶解，然后加入,45,的稀释液,100ml,，振摇,510,分钟，萃取，静置使油水明显分层，取水层作为,1,：,10,供试液。,51,油剂 取供试品,10ml,，加入无菌聚山梨酯,80 5,8ml,摇匀，再加入稀释剂至,100ml,，作为,l:10,的供试液。,栓剂 取供试品,10g,，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置,45,水浴保温,10min,使溶，加入无菌聚山梨酯,80 5,8ml,振摇使之乳化，再加入稀释剂至,100ml,，摇匀，作为,l:10,的供试液。,52,（,2,）膜剂供试品,取供试品,100cm,2,，剪碎，加,100ml,稀释液（必要时可增加用量），浸泡，振摇，作为,1,：,10,的供试液。,(3),肠溶及结肠溶制剂供试品,取供试品,10g,，,加,pH6.8,无菌磷酸盐缓冲液,(,用于肠溶制剂）或,pH7.6,无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至,100 ml,，置,45,水浴中，振摇，使溶解，作为,1,：,10,的供试液。,53,（,4,）气雾剂、喷雾剂供试品,取规定量供试品，置冰冻室冷冻约,1,小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的稀释剂（若含非水溶性成份，加适量的无菌聚山梨酯,80,）中，混匀（此液即为供试品原液），取相当于,10g,或,10ml,的供试品，再稀释成,1,：,10,的供试液。,54,（,5,）贴膏剂供试品,取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。,用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯,80,或卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少,30,分钟，制成供试液。也可采用其他适宜的方法制备成供试液。,55,（,6,）具抑菌活性的供试品,当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。,56,培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液,2ml,，每,1ml,可等量分注多个平皿（,2,个、,5,个或,10,个平皿中 （每皿,0.5ml,、,0.2ml,、,0.1ml,），倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每,1ml,供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为,1ml,的菌落数，计算每,1ml,供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。该法只适用抑菌作用不强的供试品。,57,离心沉淀法,取一定量的供试液，,500,转,/,分钟离心,3,分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。（取消了离心沉淀集菌法，该法回收率达不到要求）,58,薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的方法。（将在后面的章节中做详细介绍。）,59,中和法,凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。,表,6-l,常见干扰物的中和剂或灭活方法,60,第三节、细菌、霉菌及酵母菌,一、概述,1,基本概念,药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。,细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、,pH,值、培养温度和时间等）每,1g,、,1ml,、,10cm,2,供试液经培养后所生长的菌落数。,所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧或厌氧条件下，,30,35,，一般培养,72,小时，在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。细菌数的测定方法有多种；平皿法、薄膜过滤法、涂布法、,MPN,法是国内外药典收载的常用方法。,61,2,菌落数测定的意义,药品污染细菌的数量，是评价药品卫生质量的重要指标。其意义可概括如下：,（,1,）药品染菌量与药品的有效性相关。,微生物在其污染的药品是出于动态的不稳定的状态，随着时间延长，它们可能暂时处于停滞或逐渐趋于死亡。,但也可能在适宜的条件下，以药物为营养生长繁殖，其结果使药物产生一系列的物理和化学变化：外观颜色的改变，潮解，气味等；微生物对药物的降解作用，使其有效成分迅速破坏、变质而失去疗效，药物中污染细菌的数量与上述质量变化有着必然的因果联系，药物中污染细菌数量越多，药物变质而迅速失效的可能性越大。尤其是有些细菌的分解产物、毒素，具有极强的毒性，直接危害人类的身体健康。,62,（,2,）药品染菌量与药品的安全性相关。,药品染菌越多，致病性微生物的污染可能性越大。,有人研究细菌数量和大肠菌群检出率的关系，结果证明，药品中细菌数量越多，大肠菌群检出的几率也就越高。大肠菌群的检出，即意味着其它肠道致病菌存在的可能性增加。,有资料表明，不同细菌数和各种致病菌的相互关系，例如细菌数（,1,5,）,104,时，沙门菌阳性率为,8%,，产气荚膜梭菌阳性率为,3%,，金黄色葡萄球菌阳性率为,57%,。细菌数高，致病菌污染明显增加，有可能直接危害人体健康。,63,（,3,）药品染菌量是药品质量的重要指标之一。细菌数是评价企业综合管理水平的依据。因为要保证药品的卫生质量，必须认真做到全面的质量管理，即是考量管理人员水平、生产人员素质、科学管理的标尺。,64,二、计数方法,1,、基本计数方法,计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成,1:10,、,1:l00,、,l:1000,等稀释级的供试液。,(1),平皿法,1),常规法：取经验证的低稀释级的供试液,lml,，置直径,90mm,的无菌平皿中，注入,15,20ml,温度不超过,45,的融化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备,2,个平板。,65,2),培养基稀释法：取经验证的低稀释级的供试液,lml,，等量分注于,2,个（,2,皿法，每皿,0.5ml,）、,5,个,(5,皿法，每皿,0.2ml),或,10,个,(10,皿法，每皿,0.1ml),直径,90mm,的无菌平皿中，其它同上。,阴性对照试验 取试验用的稀释液,lml,，置无菌平皿中注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备,2,个平板，均不得有菌生长。,66,2,、薄膜过滤法,采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于,0.45m,，直径一般为,50mm,，若采用其他直径的滤膜冲洗量应进行相应的调整。,选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。,67,水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。,为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。,供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为,100ml,。总冲洗量不得超过,1000ml.,，以避免滤膜上的微生物受损伤。,68,取相当于每张滤膜含,lg,、,lml,或,10c cm,2,供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每,1g,、,lml,或,10 cm,2,所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液,lml,进行试验。用,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。,冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。,阴性对照试验,取试验用的稀释液,lml,，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,69,(2),培养和计数,培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过,100cfu,。,70,3,、培养和菌落计数,1),培养时间：,除另有规定外，细菌,30,35,培养,3,天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，如菌落极小，不易辨认，可延长培养时间至,5,天；,霉菌、酵母菌培养,5,天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时可适当延长培养时间至,7,天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。,71,2),菌落计数：,一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。,勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生,长的菌落。,注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。,必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。,72,若平板上有,2,各或,2,个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以,2,个或,2,个以上菌落计数；,若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界限，一条链、片作为一个菌落，但若链、片上出现性状、与链、片状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。,73,菌落生长呈蔓延趋势者，细菌需在,24,小时，霉菌需在,48,小时做初步点计。,点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他位置，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差。,74,3),选择计数结果：,点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于,15,则两个平板的菌落数不能相差,l,倍或以上。,一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。,75,在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。,然后将营养琼脂培养基上的霉菌及酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。,76,4,、菌数报告规则,1),常规法：细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于,300cfu,、霉菌宜选取平均菌落数小于,100cfu,的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。,当仅有,1,个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌落数；当有,2,个或,2,个以上稀释级的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告,1g,、,lml,或,10cm,2,供试品中所含的菌数。,77,如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,菌落数在,100,以内时，按实有数据报告。菌落数大于,100,时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。,78,2),培养基稀释法：每份供试液所加注平板点计的菌落之和，即为每,1ml,菌落数，共得,2,组数据。以,2,份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。其它同上。,79,3),薄膜过滤法,以相当于,1g,、,lml,或,10cm,2,供试品的菌落数报告菌数；,若滤膜上无菌落生长，以,1,报告菌数（每张滤膜过滤,lml,供试品），或,l,乘以稀释倍数的值报告菌数（每张滤膜过滤,1g,、,10cm,2,供试品）。,80,谢谢！,81,