分散固相萃取净化-UPLC-MS_MS法检测水产品中河豚毒素.pdf

浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷收稿日期：2022-09-30基金项目：国家重点研发计划(2017YFC1600701)；2022 年海洋水产科学技术提升科研项目作者简介：曾军杰(1990-)，男，浙江舟山人，工程师，硕士研究生，研究方向：天然产物的提取与分离.通信作者：张小军.E-mail:浙江海洋大学学报穴自然科学版雪允燥怎则灶葬造 燥枣 在澡藻躁蚤葬灶早 韵糟藻葬灶 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠穴晕葬贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻雪第 42 卷 第 4 期圆园23 年 7 月文章编号押 2096原4730穴圆园23雪园4原0324原06分散固相萃取净化-UPLC-MS/MS 法检测水产品中河豚毒素曾军杰，王世光，张小军(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021)摘要：对河豚鱼、织纹螺、贻贝等 12 种水产品共计 120 批次水产品中河豚毒素的定量分析，通过提取试剂的选择、净化方法的优化、净化试剂用量的研究、提取溶液 pH 的调整，以 3.0、15、50 滋g kg-13 个添加水平，进行 6 次重复实验。结果显示实验平均回收率 82.5%耀93.3%，同一浓度水平 RSD 小于 15%，线性在 2耀50 ng mL-1范围内达到 0.999 以上，检出限和定量限分别为 1.0 滋g kg-1和 3.0 滋g kg-1。表明以此前处理方法建立的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测水产品中河豚毒素含量可满足国内检测水产品中河豚毒素含量的要求。关键词：河豚毒素；分散固相萃取；超高效液相色谱串联质谱法；水产品中图分类号：TS254.7文献标识码：ADetermination of TTX in Aquatic Products by Dispersive SolidPhase Extraction Purification UPLC-MS/MSZENG Junjie,WANG Shiguang,ZHANG Xiaojun(Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Marine Fisheries Research Institute,Zhoushan316021,China)Abstract:Quantitative analysis of tetrodotoxin in a total of 120 batches of 12 aquatic products,includingpufferfish,striped snail,and mussel,was conducted.Through the selection of extraction reagents,optimizationof purification methods,research on purification reagent dosage,and adjustment of extraction solution pH,atotal of 3.0,15,50 滋g kg-1perform 6 repeated experiments with three levels of addition.The results showedthat the average recovery rate of the experiment was 82.5%-93.3%,and the RSD at the same concentrationlevel was less than 15%.The linearity reached above 0.999 within the range of 2-50 ng mL-1,with detectionand quantification limits respectively of 1.0 滋g kg-1and 3.0 滋g kg-1.This indicates that the ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)established by this pre-treatmentmethod for detecting tetrodotoxin content in aquatic products can meet the requirements for detectingtetrodotoxin content in domestic aquatic products.Vo1.42No.4Jul.,2023第 4 期Key words:tetrodotoxin;disperse solid phase extraction;ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;aquatic product河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是个别水生生物体内特有的一种高活性特殊代谢成分1-2，毒性强且性质稳定3，普通烹饪手段较难破坏。TTX 主要通过食物链被富集在水产品体内，导致水产品毒化，最终危害人体健康，甚至导致人类死亡4-5。长久以来，我国沿海地区居民食用野生河豚鱼及织纹螺导致 TTX 中毒事件频繁发生。据不完全统计，20 世纪 70 年代到 2012 年，浙江省舟山市、宁波市、温州市，福建省宁德市因食用织纹螺导致中毒，人数累计达 445 人，死亡人数达 45 人6-10。不仅如此，养殖河豚鱼中毒事件也有报道11，造成 5 人中毒，1 人死亡。目前除农业农村部认证的 16 家红鳍东方鲀 Takifugu rubripes 和暗纹东方鲀Takifugu obscurus 养殖企业外，不少养殖户的养殖品种也包括双斑东方鲀 Takifugu bimaculatus、菊黄东方鲀 Takifugu flavidus 等，存在一定的安全隐患。TTX 现有的检测方法主要有小鼠生物法12、酶联免疫法13、GC-MS 法14、HPLC-MS/MS 法15-17。生物法和酶联免疫法仅用于大量样品的筛选；GC-MS 法需要进行柱前衍生，仪器条件复杂；HPLC-MS/MS 法是目前比较常用的方法。但在用 HPLC-MS/MS 法检测时存在基质净化程度不足、回收率无法满足检测需求的问题。本文考虑水产品基质复杂，用活性炭进行净化处理，开发了 UPLC-MS/MS 测定水产品中 TTX 的新方法。1 材料与方法1.1 样品采集、预处理与保存1.1.1 样品采集样品由采样人员采集，检查、记录样品的外观、状态、特性、规格、时间要求、有无破损及其他可能对检测结果或者综合判定产生影响的情况，确认样品与抽样单的记录是否相符，检查无问题后由业务人员接收样品。1.1.2 样品预处理制样人员清洗刀、剪刀、手套等工具，工作台用洁净的塑料膜罩上并漂洗干净，带上手套，样品清洗后具体执行如下：1)鱼去头、骨、内脏，取肌肉、鱼皮等可食部分绞碎混合均匀后备用；2)虾去头、去壳和肠腺后取可食肌肉部分绞碎混合均匀后备用；3)蟹、头足类等取可食部分；4)贝类开壳剥离，收集全部软组织和体液后进行均质。样品切为不大于 0.5 cm伊0.5 cm伊0.5 cm 的小块后用组织捣碎机均质混匀备用。1.1.3 样品保存样品放入(-22耀-18 益)冷柜中冷冻保存。如样品不能及时检测，保存在-18 益以下清洁、密封的冷库中备用。1.2 仪器与试剂超高效液相色谱-串联质谱仪、Amide 色谱柱(2.1 mm伊50 mm，1.7 滋m)(美国 Waters)；冷冻离心机(美国贝克曼库尔特)；MS2 漩涡混合器(德国 IKA)；N-EVAP-112 氮吹仪(美国 Organomation)TTX 标准品(纯度逸99.0%，美国 Affix Scientific)；乙腈、甲醇、乙酸铵、甲酸、乙酸、NH3 H2O(上海国药集团)；实验用水均为哇哈哈纯净水；100 目活性炭(苏州炭旋风活性炭有限公司)。1.3 方法1.3.1 河豚毒素标准溶液的配制取 1.00 mg 包装的 TTX 标准品，用(5 mmol L-1乙酸铵+0.1%甲酸)水溶液：乙腈=1：1(V/V)溶解，定容至50 mL，配成浓度为 20.0 滋g mL-1的标准储备液。用(5 mmol L-1乙酸铵+0.1%甲酸)水溶液：乙腈=1颐9(V/V)配制成浓度为 2、5、10、20 和 50 ng mL-1的标准系列溶液。1.3.2 色谱及质谱条件的选择色谱柱：Amide 柱(50 mm伊2.1 mm，1.7 滋m)；进样体积 2 滋L；流速 0.3 mL min-1；流动相 A 为(5 mmol L-1曾军杰等：分散固相萃取净化-UPLC-MS/MS 法检测水产品中河豚毒素325浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷乙酸铵+0.1%甲酸)水溶液，B 为乙腈，洗脱条件如表 1 所示。表 1梯度洗脱条件Tab.1Gradient elution conditions时间/minA/%B/%00.601.604.104.605.0015.015.065.065.015.015.085.085.035.035.085.085.0质谱条件：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测(MRM)；扫描模式：正离子扫描模式；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：119 益；脱溶剂气温度：385 益；锥孔气流量：55 L h-1；脱溶剂气流量：800 L h-1；其他条件如表2 所示。表 2质谱参数Tab.2Mass spectrum parameters目标物母离子/(m/z)子离子/(m/z)保留时间/min锥孔电压/V碰撞能量/eVTTX320.07302.06*162.021.87452535注：*为定量离子对.图 1A、B 流动相加标色谱图Fig.1A,B flow additive chromatogram2 结果与讨论2.1 色谱条件的优化亲水性色谱柱主要用于分离强极性化合物，能够弥补 C18 色谱柱对强极性化合物保留和分离能力不足的缺点。亲水性较强的色谱柱主要有 Amide 柱和 Hilic柱，经过对比发现 Amide 色谱柱对 TTX 保留性强，分离效果好，能够满足检测需求，因此本方法选择了Amide 色谱柱作为分析柱。在酸性条件下 TTX 的胍基团易发生质子化，因此考虑甲酸-乙酸铵体系为水相，为提高 TTX 离子化效率供应了质子来源。实验考察了A(0.1%甲酸+5 mmol L-1乙酸铵水溶液甲醇)和 B(0.1%甲酸+5 mmol L-1乙酸铵水溶液乙腈)2 种流动相对分析物响应值和色谱峰的作用。结果如图 1 所示 a、b分别为流动相 A、B 洗脱的空白样品加标色谱图，以 B作为流动相能保证基质响应的干扰较低，使峰之间间距较大，分离效果好，更加容易定量。2.2 质谱条件的优化20 滋g mL-1TTX 溶液用流动注射方式 10 滋L min-1低速进入离子源，实验发现在(ESI+)模式符合 TTX检测，响应值较大，因此在此条件下全扫描确定 TTX 的分子离子M+H+(m/z 320.073 2)，对毛细管电压和锥孔电压进行优化。母离子经二级碎裂，得到子离子分别为 m/z 162.029 8、m/z 256.053 3、m/z 284.053 0、m/z 302.066 6，选取经碰撞后响应值最高的 2 个子离子分别为定量、定性离子。TTX 的二级质谱图如图 2、3 所示。0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00Time1.87(b)Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.001.871009080706050403020100(a)TTX1009080706050403020100326第 4 期图 2TTX 一级离子碎片Fig.2TTX primary ion fragment图 3二级离子碎片图Fig.3Secondary ion fragment diagram图 4不同提取溶剂对回收率的影响Fig.4Effect of different extraction solvents on recovery2.3 提取试剂的选择TTX 在碱性环境下结构容易遭到破坏，因此在提取试剂中加入少量挥发性酸。本实验分别在水、乙腈和甲醇溶液中加 1%乙酸，选取这 3 种溶液为提取剂，分别进行提取实验并对回收率进行比较，如图 4 所示。实验发现，3 种提取液均能达到 90%以上的回收率，乙腈提取效果是三者中最好的，但乙腈对人体健康会产生一定的影响；水作为无毒的提取试剂，回收率高且不含任何毒性，但由于水的沸点较高，后期处理比较困难，也不作考虑；甲醇能使蛋白质变性，且具有较强的脱水作用，能脱除甲醇溶液中一定比例的水。通过几种TTX 溶剂的综合比较，决定用 1%乙酸甲醇。提取方式：取(2.00依0.05)g 的样品，加入 10 mL 1%乙酸水，振荡混匀后超声提取 10 min，以 6 000 r min-1离心 3 min，收集液体层，残渣重复提取 1 次，合并后用1 mol L-1乙酸调至 pH 为 3耀4。2.4 净化方法的选择市场上 C18、HLB、中性氧化铝、WCX、以及 MAX 柱这些固相柱使用比较频繁，经过实验，这些固相柱均不能对 TTX 进行保留。日常检测 TTX 使用最频繁的免疫亲和柱，这种方法能够有效去除基质干扰，大大提高了对仪器设备的保护。但免疫亲和柱存在一定的缺点，主要包括价格较高、对样液 pH 要求苛刻、回收率不稳定。本方法采用活性炭为 QuEChERS 净化试剂，主要利用酸性条件下活性炭填料吸附基质中的脂质、蛋白等杂质，保留 TTX 从而达到除杂净化的目的，成本低廉，回收率高效、稳定，且成本较低，适合河豚毒素产业化。2.4.1 提取液 pH 的调整当 pH 为 3 时，活性炭净化 TTX 溶液，因为 TTX 在酸性溶液下极性较大，活性炭在除去油脂、色素等杂质时，对 TTX 几乎不吸附，这时 TTX 损失最小。样液 pH不断改变，它对的 TTX 作用力迅速变大，TTX 在碱性环图 5活性炭在不同 pH 下除杂对 TTX 回收率的影响Fig.5Effect of removing impurities by activated carbon atdifferent pH on TTX recovery提取方式1%乙酸水溶液1%乙酸乙腈溶液1%乙酸甲醇溶液10095908580757065605550100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500m/z321.074 0320.073 2子离子 2 m/z 284.053 0子离子 3 m/z 256.053 3子离子 4 m/z 162.029162.029 8178.022 4200.008 7256.055 3284.053 0子离子 1 m/z 302.066 6302.066 610001000124.075 9171.127 6144.966 6199.154 5279.050 1321.067 4393.241 0371.260 1447.266469.259 0492.319 8m/z100150200250300350400450500M+H+(m/z 320.073 2)34567pH120100806040200曾军杰等：分散固相萃取净化-UPLC-MS/MS 法检测水产品中河豚毒素327浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第 41 卷境中比较敏感，容易遭到破环，样液的 pH 只调节到 7，如图 5 所示。预处理：称取 10 g 活性炭于 100 mL 水中，持续加热 10 min，待其恢复至室温后弃去溶液。重复 3 次后将其放入烘箱，150 益干燥 3 h 后取出待用。取 25 mg 活性炭加入提取液内，振荡 1 min，随后 8 000 r min-1下离心 5 min，收集上层溶液，重复 2次，合并后 40 益下氮吹至干。用 1 mL 初始流动相复溶，涡旋后过滤待测。2.4.2 活性炭用量的研究分别以不同质量的活性炭同时净化 25 mL 的 TTX 溶液，随着质量的增加，TTX 溶液也随之变的澄清，具体结果如表 3 所示。表 325 mL TTX 溶液中加入不同活性炭量的脱色效果Tab.3The decolorization effect of adding different amounts of activated carbon to a 25 mL TTX solution活性炭使用量/mg0.10.20.30.40.50.6脱色效果不明显不明显透明溶液透明溶液透明溶液透明溶液这是由于活性炭用量较少时，所能吸附的色素、蛋白质等物质达到饱和，无法承载更多的量。当活性炭用量增加时，提取液中的杂质也全都被吸附，但由于活性炭用量过大，会导致部分 TTX 也被吸附，造成损失，于是我们选用活性炭的量为 1.2%(m/v)。2.5 线性范围和定量限配制标准曲线，如图 6 所示，分别以 TTX 的浓度和峰面积为横、纵坐标，得到回归方程为 y=869.713x-588.561，相关系数 r2为 0.999，确定检出限(LOD)为 1.0 滋g kg-1，定量限(LOQ)为 3.0 滋g kg-1，本法满足各种水产品基质检测需求。目前我国并无TTX 的限量，根据欧洲食品安全局(EFSA)规定河豚毒素 0.044 mg kg-1最低摄入水平，本方法完全能满足检测要求。2.6 回收率和精密度取 2.00 g 阴性河豚鱼，添加 3 个含量为 3.00、15.00 和 50.0 滋g kg-1的浓度，分别添加 100 ng mL-1的TTX 标准溶液 60 滋L、300 滋L、1.2 mL 进行 6 次试验。计算结果如表 3 所示。TTX 在 3.0、15.0、50.0 滋g kg-1添加浓度的平均回收率 82.5%耀93.3%，日内相对标准偏差为 3.7%耀6.3%，日间相对标准偏差 4.9%耀6.8%，如表 4 所示。图 6TTX 标准曲线图Fig.6Tetrodotoxin standard curve表 4回收率和相对标准偏差(n=6)的测定结果Tab.4Recoveries of standard addition and relative standard deviation for TTX(n=6)测定物质添加浓度/(ng mL-1)回收率/%日内相对标准偏差 RSD/%日间相对标准偏差 RSD/%TTX3.0015.0050.0082.593.389.96.35.53.75.36.84.92.7 实际样品分析采用本方法对河豚鱼、织纹螺、贻贝等 12 种水产品共计 120 批次水产品进行定量实验，如表 5 所示，其中河豚鱼、织纹螺中 TTX 检出，河豚鱼最高含量为 835.3 滋g kg-1，织纹螺为 5 220.2 滋g kg-1。实验表明，选取活性炭进行净化，采用 UPLC-MS/MS 检测水产品中 TTX，监测方式更加简便、可靠，灵敏度、准确度和回收率均适合对市场上水产品中 TTX 的检测需求。Compound name:TTXCorrelation coefficient:r=0.999678,r2=0.999 357Calibration curve:869.713伊x+-588.561Response type:External Std,AreaCurve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:Null,Axis trans:None-0.05.010.015.020.025.030.035.040.045.050.0ng/mL40 00035 00030 00025 00020 00015 00010 0005 000-0328第 4 期3 小结本研究采用分散固相萃取净化-UPLC-MS/MS，建立了一种能够检测水产品中 TTX 含量的方法。该方法前处理方法简单，相比中性氧化铝柱、C18、WCX、MAX 等固相柱具有高回收率的特点，相比免疫亲和柱又有价格低廉的优势，为水产品中 TTX 检测的首选方法，有助于长期有序、高效开展水产品在质量安全监督。参考文献：1 王艳,周培根,戚晓玉.海洋生物中毒素的研究进展J.上海水产大学学报,2002,11(3):283-288.2 方科益,陈树兵,李双,等.水产品中 11 种海洋生物毒素的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法研究J.分析测试学报,2019,38(9):1 091-1 096.3 ASAKAWA M,TOYOSHIMA T,SHIDA Yasuo,et al.Paralytic toxins in a ribbon worm Cephalothrix species(Nemertean)adherent to cultured oysters in Hiroshima Bay,Hiroshima Prefecture,JapanJ.Toxicon,2000,38(6):763-773.4 ZHOU Mingjiang,LI Jun,LUCKAS B,et al.A recent shellfish toxin investigation in ChinaJ.Marine Pollution Bulletin,1999,39(1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12):331-334.5 于鸿,李晓晶,刘苗,等.广州市水产品中海洋生物毒素急性膳食暴露风险评估J.中国卫生检验杂志,2014,24(18):2702-2 704.6 方力,邱凤梅,余新威,等.浙江沿海地市典型海产品中河豚毒素含量调查与分析J.中国卫生检验杂志,2017,27(6):886-888;891.7 罗璇,于仁成,王晓杰,等.中国沿海部分地区半褶织纹螺的毒性及毒素组成分析J.海洋与湖沼,2016,47(2):327-335.8 水黎明,陈坤,王建跃,等.19772000 年舟山市织纹螺中毒流行病学特征及毒理学监测结果分析J.海峡预防医学杂志,2001,7(5):4-7.9 郭胜利.22 起食用织纹螺中毒事件的分析J.现代预防医学,2012,39(14):3 515-3 516.10 林学尧,林洁,张秀尧,等.多起食用织纹螺中毒的流行病学调查J.中国卫生检验杂志,2015,25(10):1 646-1 648.11 胡艳敏,张峰,芦丽嫦.一起食用养殖河豚鱼中毒死亡事件的调查分析J.中国农村卫生事业管理,2017,37(4):420-421.12 周晓翠,谢光洪,刘国文,等.河豚毒素检测方法的研究进展J.中国畜牧兽医,2008,35(7):43-46.13 WATABE S,SATO Y,NAKAYA M,et al.Monoclonal antibody raised against tetrodonic acid,a derivative of tetrodotoxinJ.Toxicon,1989,27(2):265-268.14 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