DB51∕T 1679-2013 水稻纹桔病菌对井冈霉素抗药性室内测定技术规程(四川省).pdf

ICS DB51 四川省地方标准 DB 51/ XXXXX2013 水稻纹枯病菌对井冈霉素抗药性 室内测定技术规程 （报批稿） 2013 - XX - XX 发布 2013 - XX - XX 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/ XXXXX2013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 仪器及用具 . 1 3 试剂和材料 . 1 4 方法 . 1 5 数据统计及分析 . 2 6 结果判定 . 2 附录 A（资料性附录） 试验药剂计算方法. 4 附录 B（资料性附录） 水稻纹枯病田间症状描述. 5 DB51/ XXXXX2013 II 前 言 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：四川省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：李洪浩、吴婕、向运佳、彭化贤、刘波微、席亚东、温静、王晓黎、黄晶。 DB51/ XXXXX2013 1 水稻纹枯病菌对井冈霉素抗药性 室内测定技术规程 1 范围 本标准规定了水稻纹枯病菌对井冈霉素抗药性室内测定技术。 本标准适用于四川省水稻纹枯病菌室内对井冈霉素的抗药性评价。 2 仪器及用具 冰箱、超净工作台、称量纸、打孔器（直径5mm）、电炉、电子天平、高压消毒锅、酒精灯、接菌针、刻度试管、滤纸、镊子、培养皿、容量瓶、烧杯、生化恒温箱、锥形瓶、手术刀或剪刀、吸管、移液器。 3 试剂和材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和无菌蒸馏水。 马铃薯、葡萄糖、琼脂、井冈霉素原药A和70%酒精。 4 方法 4.1 含药培养基的制作 取适量井冈霉素原药A，用无菌蒸馏水溶解配制成母液，再分别用无菌蒸馏水稀释成系列浓度的药液。在无菌操作条件下，根据试验处理将预先融化的灭菌PDA培养基定量加入无菌锥形瓶中，按照药液与培养基体积比1:9，从低浓度到高浓度依次定量吸取药液，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀。然后分别倒入3个培养皿中，每皿15mL，制成相应浓度的含药平板。 试验药剂计算方法见附录A。 4.2 水稻纹枯病菌样品的采集 在水稻抽穗期采集带有典型水稻纹枯病症状的病稻秆，装入纸质袋内，记载采集地点、时间、品种名称和采集人。水稻纹枯病田间症状描述见附录B。 4.3 水稻纹枯病菌的分离和培养 水稻纹枯病菌必须是从当年采集样品中分离获得的分离物。 用剪刀将水稻叶片的病健部剪成直径为4mm5mm的小块，放入无菌蒸馏水中清洗30s，再放入70%酒精中清洗15s，重复两次后再用无菌蒸馏水清洗，用无菌滤纸吸去样品上的水分后，将样品转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，置于恒温箱（261）内培养。24h后切取样品周围含有菌丝的培养基，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，置于恒温箱（261）内培养备用。 DB51/ XXXXX2013 2 4.4 抗性测定 采用生长速率法测定，用已灭菌的打孔器（直径5mm）在菌龄相同、培养2d的水稻纹枯病菌边缘取菌块，用接菌针挑取菌块，菌丝面向下置于不同浓度梯度的含药培养基平板中心，每皿1块，置于恒温箱（26 1 ）内培养，每个处理重复3次，以加入无菌蒸馏水的培养基为空白对照。待对照菌落长至直径约7cm后，用十字交叉法测量菌落生长直径。 5 数据统计及分析 5.1 计算方法 根据调查数据，按公式(1)计算各处理水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制率，计算结果保留小数点后2位有效数字。 100AAAAI0121=. (1) 式中： I 病菌生长抑制百分率； A0菌块直径； A1对照菌落直径； A2药剂处理菌落直径。 5.2 统计分析 根据药剂浓度对数值及对应病菌生长抑制率的机率值建立线性回归方程（Y=a+bx，Y为抑制效果机率值，x为浓度对数值，a、b分别为常数），计算相关系数、EC50值和置信限。 5.3 敏感基线（EC50值）的确立 以菌株敏感性频率分布图的方法确立敏感基线。测定所有供试水稻纹枯病菌对井冈霉素的敏感性（EC50值），根据EC50值的大小，以一定截距把EC50值划分成不同区段（一般六个区段），计算出每区段菌株个数与频率。以每区段EC50中值为横坐标，对应频率为纵坐标，绘制出频率-EC50值分布图。分布曲线代表水稻纹枯病菌对井冈霉素的不同敏感性水平， 第一个正态曲线的中值为水稻纹枯病菌对井冈霉素的敏感基线。敏感基线参考值为154.57g/mL。 6 结果判定 6.1 抗性水平划分 抗性菌株频率计算见公式（2）, 计算结果保留小数点后2位有效数字。 敏感基线值供试菌株抗性水平50EC=. (2) 式中： 抗性水平5为敏感菌株；5抗性水平10为低抗菌株；10抗性水平100为中抗菌株；抗性水平100为高抗菌株。 6.2 抗性评价 DB51/ XXXXX2013 3 根据抗性水平将供试菌株划分为敏感菌株和抗性菌株。 再根据抗性菌株在群体中出现频率计算出抗性菌株频率。抗性菌株频率计算见公式（3）, 计算结果保留小数点后2位有效数字。 ( )100%=供试菌株数量抗性菌株数量抗性频率. (3) DB51/ XXXXX2013 4 A A 附 录 A （资料性附录） 试验药剂计算方法 A.1 原药取用量 原药取用量X1(g)按式(A.1)计算： P10VCX611=. (A.1) 式中： X1原药取用量，单位g； C 母液质量浓度，单位g/mL； V1母液体积，单位mL； P 原药浓度（有效成份），单位%。 A.2 母液取用量 母液取用量X2(g/mL)按式(A.2)计算： C10VAX622=. (A.2) 式中： X2 供试药液质量浓度，单位g/mL； C 母液质量浓度，单位g/mL； V2含药培养基体积，单位mL； A 试验浓度，单位g/mL。 DB51/ XXXXX2013 5 B B 附 录 B （资料性附录） 水稻纹枯病田间症状描述 水稻纹枯病又称云纹病，俗名花足秆、烂脚瘟、眉目斑，由无性世代为半知菌亚门丝核属立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Khn）、有性世代为担子菌亚门亡革菌属瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk.）引起的水稻病害。多在高温、高湿条件下发生侵染。水稻纹枯病在南方稻区为害严重，是当前水稻生产上的主要病害之一，使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，粒重下降。 叶鞘染病：近水面处产生暗绿色水浸状边缘模糊小斑，后逐渐扩大呈椭圆形或云纹形，中部呈灰绿或灰褐色，湿度低时中部呈淡黄或灰白色，中部组织破坏呈半透明状，边缘暗褐色。发病严重时数个病斑融合形成大病斑，呈不规则状云纹斑，常致叶片发黄枯死； 叶部症状：病斑呈云纹状，边缘褪黄； 茎秆受害：初为污绿色，后变灰褐色，常不能抽穗，抽穗的秕谷较多。湿度高时病部长出白色网状菌丝，后汇聚成白色菌丝团并形成菌核，菌核深褐色，易脱落。 _