DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第 四 节,DNA,限制酶切反应和,限制酶谱绘制,一,DNA,的限制酶反应,1.,酶单位定义,:,使,1g,某种,DNA,在最适反应条件下和,1,小时内完全酶切所需的限制酶活性。,2.,酶切反应类型,1),完全酶切,SV40(5243bp)pBR322(4363bp),2),部分酶切,3.,酶切反应最适条件,1),DNA,分子的组成,i.,碱基组成与排列方式,ii.,识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一,DNA,分子中不同识别位点的酶切速度可相差,10,倍（如,中的,Eco,RI,位点）,2),反应条件,i.,DNA,溶液的纯度和浓度,（反应浓度）,依实验目的而定,Hpa,I,(C CGG),1 26,Tha,I,(CG CG),0 23,ii.,限制酶的纯度和稳定性,i),纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件,ii),稳定性：保存和反应,iii.,反应缓冲液,：,常用三种核心缓冲液，即高（,H,），中（,M,），低（,L,）盐缓冲液，不同温度下的,pH,值,iv.,反应温度,：,大多数为,37,v.,双酶切和多酶切反应,同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者,-,分别酶切。,i),第一种酶切 电泳检查 酚,/,氯仿纯化 第二种酶切。,可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。,ii),采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查 采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。,假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。,如,Sma,I-,Bam,H(c),Bam,H,I-,Sma,I(p),二、限制酶图谱的绘制,1.,完全酶切作图法,1,）,单酶切作图法,一长度为,5Kb,的线状,DNA,分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。,i.,单酶部分酶切,：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个,DNA,片段才有可能出现在凝胶上。,ii.,末端标记完全酶切,DNA,片段 末端标记 完全酶切 凝胶电泳,EtBr,染,色观察 放射自显影,2),双酶切作图法,单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行,分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图,根据上述的原理和步骤，前述的,5 Kb,片段酶,I,与酶,II,的定位结果可用两种方法之一：,i),单酶切 分离,DNA,片段 第二种酶切 凝胶电泳,ii),单酶切 第二种酶切 凝胶电泳,*如果要同时将两种限制酶定位在一条,DNA,上时，单酶完全酶切作图就没必要了。,2.,末端标记,-,部分酶切作图法,（,Smith-Brinstiel,法）,DNA,片段 末端标记,酶,1,切 分离带标记,DNA,片段 酶,2,部分酶切 电泳,EtBr,染色照相 放射自显影,结果,单端标记方法,:,人工合成单端标记法,限制酶切单端标记法,单端标记方法,1,人工合成单端标记法,单端标记方法,2,限制酶切单端标记法,3.,末端标记双相作图法,方法,2,仍存在两个不足之处：酶,1,的选择不能靠近,DNA,中央；需先分离,DNA,片段，该法可克服上述缺点。,现假设有一片段长,10 Kb,，其中,RE1,有三个切点，,RE2,有一个切点，其图谱可能是,:,4.,Bal31,顺序酶解作图法,DNA,片段,Bal31,处理不同时间取样终止反应 限制酶切,凝胶电泳 染色观察结果,5.,切口移位作图法,(,可检测出,100bp,片段,),双链,DNA,切口移位 限制酶切 电泳 放射自显影,6.,大尺度限制酶作图,1),条件,i.,电泳方法,-,脉冲场凝胶电泳,ii.,样品制备,-,原位,DNA,制备和酶解,iii.,人工染色体构建,-pYAC,载体构建,iv.,脊椎动物基因组中的,CpG,和植物基因组中的,CpXpG,序列存在,2),一般作图程序,原位,DNA,样品制备 原位,DNA,限制酶切 脉冲场凝胶电泳 染色 观察,3),大尺度作图用酶,i.,稀有识别序列内切酶,-I,型内含子内切酶,(,真菌细胞核和线粒体基因组,T4,噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体,),；酵母,HO,内切酶；大肠杆菌,recA,虽然这些内切酶识别的序列都很长：,10-19 bp,，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用,ii.,II,型限制酶,人基因组有,45,000,个,CpG,岛,一个长度约为,1.5 kb,富含,GC,的,DNA,片段,其中只有,25%,的,CpG,岛未被甲基化,这些,CpG,岛常位于基因的,5-,端,未被甲基化的,CpG,岛平均长约,270 kb,可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别,8,或,6 bp,序列；富含或只含,GC,序列；含有,CpG,序列,i),Asc,I-GG,CGCG,CC,和,Not,I-G,CG,GC,CG,C,ii),Fse,I-GGC,CG,GCC,和,SrF,I-GCC,CG,GGC,iii),Sfi,I-GGC,CN,NNNNGGCC,iv),Cpo,I/,Csp,I/,Rsr,II-,CG,GA(T)C,CG,v),Bss,HI-G,CGCG,C,Eag,I-,CG,GC,CG,和,Sac,II-C,CGCG,G,vi),Nae,I-GC,CG,GC,Nar,I-GG,CG,GC,Sma,I-CC,CG,GG,vii),Mlu,I-A,CGCG,T,Nru,I-T,CGCG,A,Pvu,I-,CG,AT,CG,Spl,I-,CG,TA,CG,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,三,.,限制酶图谱的用途,1.,基因工程中的应用,1),克隆载体图谱,便于,DNA,重组,;,2),克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序,.,2.,突变体检测,遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了,基因型和表型的变化,.,限制酶图谱,不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即,表型的变化不一定会导致酶谱变化,.,1),缺失突变体的检测,:,某,DNA,片段消失,代之以一较小,DNA,片段,.,2),插入突变体的检测,:,某,DNA,片段消失,代之以一较大,DNA,片段,.,缺失和插入突变体的检测（,I,）,I II,点突变的检测（,II,）,3,）点突变的检测,:,某,DNA,片段消失,代之以两较小的,DNA,片段,.,前者的长度等于后两者长度之和,(,位点增加,),；某两,DNA,片段消失,代之以一较大,DNA,片段，前者的长度之和等于后者长度,(,位点消失,).,3.,重组频率的测定,同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗传多型性,.,等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制酶片段长度多型性,(Restriction fragment length polymorphism,RFLP,),不同个体 总,DNA,限制酶完全酶切,Southern,印迹,杂交 结果分析,当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为,:,表型 红,:,白,=1:1,限制酶谱,30%,个体已发生了重组,.,4.,遗传疾病的诊断,分析正常人与遗传病患者的某些,DNA,片段的限制酶谱,便可发现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病,.,第五节,DNA,的 连 接,一,.DNA,的连接方法,两种不同的,DNA,分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的,DNA,结构,.,1.,直接连结法,-,该法适用于,:,1),同种限制酶作用不同,DNA,片段产生的,相同粘性末端,重组,DNA,可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外,(,如,Ara,I),2),不同种限制酶作用不同,DNA,片段产生的,相容性末端,i.,重组,DNA,分子不能再为这两种酶所作用,如,:,Bam,HI/,Bgl,II,ii.,重组,DNA,分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如,Mbo,I/,Bam,HI,3)PCR,产物与特定载体的连接,4),限制酶和其他方式产生的,平整末端,.,2.,人工接头连接法,1),人工接头（,linker,）的结构,i.,中轴对称互补,可自行退火形成双链,.,如,:,5-CCG,GAATTC,CGG-3,3-GGC,CTTAAG,GCC-5,ii.,至少有一特定的限制酶识别位点,iii.,某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相,.,如,:,八聚体,d(G,GAATTC,C),十聚体,d(CG,GAATTC,CG),十二聚体,d(CCG,GAATTC,CGG),2),用途,i.,平整末端的连接,(,各种结构的,DNA,末端均可经过修饰变成平整末端,),2 X 5-CCG,GAATTC,CGG-3,退火,ii.,产生新的克隆位点,iii.,合成匹配接头,3),连接方法,人工接头磷酸化 退火形成双链 与目的,DNA,相连 限制,酶切 两,DNA,分子相连,4),适用范围,人工接头连接法适合于那些只有一种,DNA,片段需加人工接头就可以与另一,DNA,分子相连的,DNA,分子,.,利用人工接头也可使任意两个平端的,DNA,分子相连,.,这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的,DNA,可能具有不同的结构,.,为避免这些结构的产生,可先使一种,DNA,先加上人工接头后,再与另一种,DNA,分子相连,.,3.,匹配接头连接法,人工接头虽然可连接两个具不同末端的,DNA,分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端,.,然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的,DNA,分子,:,i.,平端,+,突起末端,(5-,突起,3-,突起,),ii.,粘性末端,(5-,突起,+5-,突起,:,Eco,RI+,Hin,dIII,5-,突起,+3-,突起,:,Eco,RI+,Pst,I,3-,突起,+3-,突起,:,Pst,I+,Sac,I),1),匹配接头的结构特点,i.,由两个低聚核苷酸组成,ii.,部分区域可以互补,iii.,退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端,2),匹配接头的种类,i.,预制匹配接头,(,连接平端和粘性末端,),人工接头,+,匹配接头 预制匹配接头,ii.,转换匹配接头,(,连接,5-,突起和,3-,突起末端,),二匹配接头退火 转换匹配接头,二人工接头 连接酶 双酶切 转换匹配接头,iii.,单链匹配接头,(,连接,5-,突起和,3-,突起末端,),4.,同聚物加尾连接法,在两个不同的,DNA,分子末端各加上一个可互补的同聚物,即,AT,或,GC.,5.,连接方法的选择,方法选择的依据,:,1),两,DNA,分子的末端结构,2)DNA,分子的限制酶谱,3),是否需要回收,DNA,片段,连接方式的选择,载体末端 外源,DNA,末端 常规连接 脱磷酸化 同聚物 平端连接 补齐,人工接头,结构 结构 载体 加尾 外切酶,5-,突起 相容,5-,突起 第二选择 第一选择 不能 不能 不能,5-,突起 非相容,5-,突起 不能 结合使用接头 不能 不能 第一选择,3-,突起 相容,3-,突起 唯一选择 不能 不能 不能 不能,3-,突起 非相容,3-,突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择,或平端,3-,突起,5-,端突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择,(,补齐后,),平端 平端 不能 可能 可能 第一选择 可能,平端,3-,或,5-,突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择,二,.DNA,的连接反应,1.,连接反应理论,当两种,DNA,分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关,:,1),连接反应系统中的总,DNA,浓度,i,2),一个,DNA,分子靠近同一分子另一端的有效浓度,j,该值与,DNA,的长度成反比,即,DNA,分子越大,该分子的两末端越不易相互作用,(,即自身环化,),3),两种不同,DNA,分子的克分子浓度之比值,.,2.,连接反应条件,1),评估连接反应结果的方法,i.,琼脂糖凝胶电泳,ii.,大肠杆菌转化,2),反应条件,i.,温度,ii.ATP,浓度,iii.,时间,iv.,连接酶浓度,v.,克分子比率,第六节,PCR,技 术,一,DNA,体外扩增技术,1.,PCR,反应体系,1),基本原理,(PCRPolymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应,),一个,DNA,经,n,次扩增后,一个,DNA,分子可变为,2,n,个分子,DNA,扩增需要对待扩增的,DNA,序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物,2),基本操作,待扩增的,DNA,片段,+dNTP+TrisHCl,缓冲液,+,两引物,90,变性,30 50,退火,30,加入,Taq DNA,聚合酶,75 1,进入第二次循环,25-30,次循环,PCR,原理示意图,2.PCR,产物的鉴定,1)PCR,产物的大小和限制酶谱分析,2),寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（,OR,分析,，,Oligomer Restriction analysis,）,OR,分析对于,PCR,产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用,PCR,产物的,OR,鉴定,3),分子杂交,适合于检测,PCR,产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性,DNA,片段作探针,(,常为人工合成的一段低聚核苷酸，约,20 n.t.).,当这种探针的核苷酸序列与待测的,DNA,核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（,allele-specific Oligonucleotide,ASO,）与,PCR,产物进行杂交，可检测出,PCR,产物的碱基突变。,可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析,4),核苷酸序列分析,DNA,扩增产物 变性 与末端标记的扩增引物或定序引物退火 双脱氧核苷酸链终止反应，测定,DNA,序列,二,Taq DNA,聚合酶的特点,Taq DNA,聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌,YT-1,中分离纯化而得。该酶的分子量为,63-68 kD,1.,无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切,酶活性,，但具有依赖于聚合酶活性的,5 3,外切酶活性,2.,最适反应温度为,80,3.,最适,pH8.0,和最佳反缓冲液,TrisHCl,4.,最佳二价阳离子,Mg,2+,（,10 mM,）,5.,具良好的热稳定性：在,90,下连续反应,30,分钟仍有,70%,的酶活,Taq DNA,聚合酶的特性,当采用,Taq DNA,聚合酶进行,DNA,体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：,1,）,热稳定性,：在,PCR,循环中,DNA,的变性时间常为,30-60,，若循环,30,次，其累计加热变性时间为,15-30,。,Taq DNA,聚合酶在,90,下保温,30,仍具有,70%,酶活性，可大大减少操作步骤，,易于实现自动化,*,2,）,模板与引物的特异性,：当,退火温度和,DNA,链延伸,时温度,偏低,时，引物与模板配对的,特异性大大降低,，从而导致一些不需要的,DNA,片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于,Taq DNA,聚合酶最适反应温度为,80,，退火温度可提高到,55,以上,，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使,产物均一性大大增加,*,3,）,合成产率,：反应底物和产物在,DNA,扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入,平台期,，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用,Klenow,片段进行,20,次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为,210,5,，当采用,Taq DNA,聚合酶时，扩增,25,次后才进入平台期，拷贝数可大,410,6,*4,）,延伸长度,：有时为了获取较长,DNA,片段的扩增，这就要求,DNA,聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于,250 bp,时，,Klenow,片段和,T4,聚合酶扩增产率大大降低。利用,T7 DNA,聚合酶,，可使扩增片段达,2 Kb,。当利用,Taq DNA,聚合酶,时，最长延伸长度为,4.4 Kb,.,经改造的,Taq DNA,聚合酶可扩增出,40 kb,的,DNA,片段,.,5,）,扩增产物的可靠性,：评估,DNA,聚合酶的一个重要指标是它复制,DNA,的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于,PCR,技术的可靠性是至关重要的。,Klenow,片段的错误掺入率为,10,-4,，,Taq DNA,聚合酶的错误掺入率为,510,-3,，而,T4,聚合酶的错误掺入率为,10,-7,。,*注：,1,）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，,引物越长或,GC,含量较高，退火的温度可以高些,，,反之则低,些。退火温度越高，引物与模板（即扩增的,DNA,）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性,DNA,片段的扩增。,引物的长度常为,20-28,聚体，其中有,50%,以上的,GC,含量，无自身互补序列，特别是,3,末端不应有内部二级结构，引物加量为每,100l l20pmol.,*2),出现平台期的原因可能有,：后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；,dNTP,耗尽；产物浓度过高，以致,ds-DNA,解链后又迅速退火，不能与引物结合。,*,3,）,链延伸长度与延伸时间有关,，对于,Taq DNA,聚合酶，每分钟可形成,2000 n.t.,或更多。如果要扩增,3-4 Kb,的,DNA,，在,72,下需将酶延伸时间增至,3-4,分钟。,三,PCR,方法,1.,强化,PCR,（,Boosted PCR,）,将,PCR,分为两个阶段：,1,）引物与模板之比为,10,7,，扩增,20,个周期,2,）引物与模板之比为,10,12,10,13,，再扩增,10,个周期,该法适合于待扩增,DNA,浓度较低时。,2.,混合寡核苷酸引物,PCR,（,mixed oligonucleotide primed amplification of cDNA,MOPAC,）,根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一特定,cDNA,进行扩增。,3.,锚定,PCR,(Anchored PCR,，,A-PCR),4.,连结,PCR,(ligation mediated PCR),该法可用于核苷酸序列测定,DNA,足迹分析技术和测定甲基化作用,5.,不对称,PCR(Asymmetrical PCR),采用不同引物浓度比率，如,50,：,1,，,100,：,1,，可得大量拷贝的,ssDNA,用于测序,6.,GC,串,PCR(GC clamp PCR),应用,变性剂梯度凝胶电泳,(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),可检测出,DNA,片段中一对碱基的变化，在,DNA,分子一端加上一,GC,串（约,40 n.t.,）利用它的高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原,DNA,链中最高解链区内的点突变,7.,竞争引物,PCR,(competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR),有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争,DNA,模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一,DNA,片段上是否带有某一已知碱基置换。,8.,等位基因专一,PCR(Allele specific PCR,ASPCR),该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。,9.,反转,PCR,(inverserar inverted PCR),该法可用于扩增已知,序列两侧的未知序列,10.,反向,PCR,(reverse transcription PCR,RT-PCR),主要用于,mRNA,的,PCR,扩增,11.,加端,PCR(Add-on PCR),在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列,12.,错配,PCR,（,mismatched PCR),利用该法可在一已知,DNA,序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。,13.,重组,PCR,(Recombinant PCR),利用该法可将不同基因的,DNA,片段连接在一起。,14.,基因克隆,PCR,利用该法可获一完整的,cDNA,克隆。,四,.,定量,PCR,技术,1.,基本原理,N=N,0,(1+eff),n,N-,最终拷贝数；,N,0,-,起始拷贝数；,eff-,扩增效率；,n-,扩增次数,2.,测定方法,竞争,PCR,法,(,加入已知量的标准物,),；,RT-PCR-,转录法,五,PCR,技术的应用,1.,遗传疾病的诊断,人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了,AT,的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代,。,AT,突变还导致限制酶,Oxa,NI,位点的消失,。,利用,PCR,技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下：,DNA,扩增,PAGE,染色 观察 比较不同个体的结果,限制酶切,PAGE,染色 观察,此法可在,3-4 h,获得结果，比常规的,Southern,杂交法简便、快速。,2.,传染病的诊断,如果已知某种病原菌,(,体,),中的特异性,DNA,片段的核苷酸序列，这个片段就可以用于,DNA,扩增，并利用,DNA,杂交或凝胶电泳的方法诊断病原体的存在与否。,例如,AIDS,的诊断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要,3-4,个星期，采用,PCR,技术则只需一天左右，且准确率高,3.,基因的快速克隆,根据已知基因序列设计,PCR,引物,可直接在不同的样品中进行,PCR,扩增,而不必分离纯化生物样品,4.,基因突变,1,）缺失突变,2,）插入突变,3,）点突变,-,单点和多点突变,六,.,等温,3SR(self-substained sequence replication),反应系统,七,.,等温链取代扩增反应系统,(SDA,strand displacement amplification),等温,3SR,反应系统,(self-substained sequence replication),等温链取代扩增反应系统,(SDA,strand displacement amplification),