DB51∕T 2169-2016 标准菌株的保存与使用指南(四川省).pdf

ICS 03.120.10 A 00 DB51 四川省地方标准 DB51/T 21692016 标准菌株的保存与使用指南 2016 - 05 - 18 发布 2016 - 10 - 01 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/T 21692016 I 目 次 前 言 . II 引 言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 标准菌株获取与保存 . 2 5 从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株 . 2 6 从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株 . 3 7 从储备菌株制备工作菌株 . 4 8 销毁 . 4 9 记录 . 5 附录 A（资料性附录） 部分已获认可的标准菌株提供者名录. 6 附录 B（资料性附录） 标准菌株制备流程图. 7 参考文献 . 9 DB51/T 21692016 II 前 言 本标准为实验室质量管理和技术运作类标准。 建议实验室将该标准与下列实验室质量管理和技术运作系列标准结合起来使用。 微生物检测领域培养基和试剂的验证 微生物检测领域培养基和试剂的管理 微生物检测实验室安全管理指南 微生物检测实验室设施和环境条件监测指南 微生物检测实验室废弃物处置指南 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院负责解释。 本标准起草单位：四川省产品质量监督检验检测院，成都市食品药品监督管理局,四川省食品药品检验检测院，成都市疾病预防控制中心 本标准主要起草人：时炜，郑卫东，黄薇，胡丹，黄瑛，文永勤。 DB51/T 21692016 III 引 言 标准菌株是微生物检测结果溯源的有效途径之一，广泛应用于培养基（试剂）验收、方法确认/证实、试验阳性/阴性对照、人员培训考核和结果的质量保证等方面。标准菌株的溯源性与稳定性，对于确保微生物试验结果的准确性，具有重要作用。 本标准提出标准菌株的保存与使用指南，旨在为实验室提供管理的科学路径，以满足相关要求。 本标准由范围、规范性引用文件、术语及定义、标准菌株、从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株、从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株、从储备菌株制备工作菌株、销毁、记录和一个资料性附录构成。 DB51/T 21692016 1 标准菌株的保存与使用指南 1 范围 本标准规定了标准菌株的保存和使用要求。 本标准适用于属于本标准定义的标准菌株的管理。 实验室其它途径获得的、不属于本标准定义的菌株，其管理可参考本标准执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2158 实验室服务和供应品采购管理指南 DB51/T 2165 微生物检测领域培养基和试剂管理指南 3 术语和定义 GB 4789.28 界定的以及下列术语和定义适用于本标准。 3.1 标准菌株 reference strain 直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株,按菌株特性进行分类和描述。 注1：标准物质是指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种。 注2：经证明的标准物质是指其浓度已经证明。 3.2 标准储备菌株 reference stocks 将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套与标准菌株完全相同的独立菌株。 3.3 储备菌株 stock culture 从标准储备菌株转接一代获得的培养物。 3.4 工作菌株 working culture 由标准储备菌株、储备菌株或标准菌株转接一代获得的菌株。 3.5 代 generation DB51/T 21692016 2 将微生物接种至一新鲜培养基上或其中，每萌发一次即称为一代。 4 标准菌株获取与保存 4.1 标准菌株的获取途径 4.1.1 菌种收藏所(NCTC)、中国医学菌种保藏管理中心（CMCC）、中国普通微生物菌株保藏管理中心（CGMCC）、中国药学微生物菌种保藏管理中心（CPCC)、中国兽医微生物菌株保藏管理中心（CVCC）、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)等。 注：上述已获得认可的标准菌株提供者中英文名称对照见附录A。 4.1.2 如从商业机构获得标准菌株，应有标准菌种的保藏机构名称缩写及菌种编号，如大肠埃希氏菌ATCC 25922、肠炎沙门氏菌 CMCC（B）50040、嗜水气单胞菌 AS1.1814 等。 4.1.3 从上级机构下发的质控盲样中分离出的菌株，被证明结果是正确的、且从考核机构获得该菌种的保藏机构名称缩写及菌种编号的，也可作为标准菌株使用。 4.2 购买 应从行业内广泛认可的菌种收集途径获取标准菌株， 如从标准菌种保藏中心或其他有效的、 经过认证的商业机构获得原包装的标准菌株。 4.3 验收 实验室应制定标准菌株验收控制程序，确保所获取的标准菌株满足要求。 4.4 保存 通常情况下，应按照制造商提供的使用说明进行保存。 注：未开启原包装的标准菌株通常视为第0代。 5 从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株 5.1 复苏 拆开标准菌株的包装，按说明书的要求，将标准菌株转种于适当的培养基内，于适当温度下培养适当时间，进行复苏。 注1：通常将标准菌株悬浮于营养肉汤中进行复苏。对冻干菌种，复苏操作可能较为繁琐。 注2：经过一步复苏的菌株为第1代菌株。 5.2 平板分离 应按照制造商提供的使用说明， 采用合适的非选择性平板对复苏的标准菌株进行分离， 于适当温度下培养适当时间。 注1：通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注2：在平板上分离的菌株为第2代菌株。 5.3 确认 DB51/T 21692016 3 应对平板分离出的菌落进行确认。确认的内容包括存活性、纯度，实验室中所需要的其他关键特征指标（如菌落形态、革兰氏染色、生化试验、血清学实验等）。记录确认的结果并予以保存。 5.4 制备标准储备菌株 5.4.1 在开展确认试验的同时，挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液，分装于菌株保存容器中，需同时制备多份。需对每一支菌种保存容器进行适当标识，标识内容包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 注1：若确认试验不合格，则将制备的标准储备菌株弃去。 注2：制备菌悬液时，若需低温保存，应加入保护剂。如果采用-70低温冻存，可在TSB中添加10%-15%的甘油作为冷冻保护剂。 5.4.2 根据菌株的特性，选择使用冻干保藏、利用多孔磁珠在-70冰箱、液氮罐或其他有效的保藏方法进行保藏。操作中，应避免交叉污染，减少菌株突变或发生典型特性变化。 注1：制备的标准储备菌株为第2代菌株。 注2：推荐采用超低温（-70） 或冻干的方法保藏。在较高温度下，应适当缩短贮存时间。 注3：标准储存菌株不应用来制备标准菌株。 5.5 制备工作菌株 可同时挑取纯菌落转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌株。需同时制备多份，并作好标识，标识内容需包括菌株名称、菌株号、接种日期和所传代数等信息。 注1：斜面上的工作菌株为第3代菌株，可在工作中使用。 注2：可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3：工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。存放4周后，应转接下一代工作菌株。当工作菌株代数小于5时，可直接用上一代工作菌株转接下一代工作菌株。 注4：从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株的过程，可参考资料性附录B。 6 从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株 6.1 转种 取一支冷冻保存的标准储备菌株，迅速解冻，制成菌悬液，转种于合适的非选择性平板上，于适当温度下培养适当时间。 注1：应根据菌种类型及其保存方式确定标准储备菌株转种时间，在规定的时间内转种。 注2: 通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注3：转种在平板上的菌株为第3代菌株。 6.2 验证 对平板分离出的菌落，应进行纯度与形态验证，记录验证的结果并保存记录。 注：也可以采取5.3的方式对菌株进行再次确认。 6.3 制备储备菌株 6.3.1 在验证的同时，挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液，分装于菌株保存容器中，需同时制备多份。对每一支菌种保存容器进行适当标识，标识内容需包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 DB51/T 21692016 4 注1：若验证不合格，则将制备的储备菌株弃去。 注2：若为需低温保存的菌株，在制备菌悬液时，应加入保护剂。例如采用-70低温冻存，可在TSB中添加10%-15%的甘油作为冷冻保护剂。 6.3.2 根据菌株的特性，选择使用冻干保藏、利用多孔磁珠在-70冰箱、液氮罐或其他有效的保藏方法进行保存。 注1：制备的储备菌株为第3代菌株。 注2：推荐采用超低温（-70） 或冻干的形式保藏。在较高温度下，应适当缩短贮存时间。 注3：储备菌株不应用来制备标准储备菌株和标准菌株。 6.4 制备工作菌株 可同时挑取纯菌落转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌种。需同时制备多份，并进行适当标识，标识内容需包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 注1：斜面上的工作菌株为第4代菌株，可在工作中使用。 注2：可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3：工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。存放4周后，应转接下一代工作菌株。当工作菌株代数小于5时，可直接用上一代工作菌株转接下一代工作菌株。 注4：从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株的过程，可参考资料性附录B 7 从储备菌株制备工作菌株 7.1 转种 取一支冷冻保存的储备菌株，迅速解冻，制成菌悬液，转种于合适的非选择性平板上，于适当温度下培养适当时间。 注1：应根据菌种类别及其保存方式确定储备菌株存放时间。超过规定的时间，应予以销毁，除非标准方法中有明确要求或实验室能够证明其相关特性没有改变。 注2: 通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注3：转种在平板上的菌株为第4代菌株。 7.2 验证 验证使用平板分离菌落的纯度，记录验证的结果并保存记录。 注：也可以采取5.3的方式对菌株进行再次确认。 7.3 制备工作菌株 同时挑取纯菌落转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌株，需同时制备多份。并进行标识，标识内容需包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 注1：斜面上的工作菌株为第5代菌株。 注2：可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3：工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。超过4周，应予以销毁，除非标准方法中有明确要求或实验室能够证明其相关特性没有改变。 注4：工作菌株不应用来制备储备菌株、标准储存菌株和标准菌株。 8 销毁 DB51/T 21692016 5 将以下菌株灭菌处理后丢弃： a) 拆开后的标准菌株、标准储备菌株、储备菌株以及传代培养次数大于 5 次的工作菌株； b) 经确认或验证不合格的菌株； c) 超过保藏期限的菌株。 9 记录 菌株的保存与使用记录应予妥善保存，记录内容包括（但不限于）以下内容： a）从原始菌种（标准菌株）传代到工作用菌种的代数； b）菌种生长的培养基及孵育条件； c）菌种生存条件。 DB51/T 21692016 6 A A 附 录 A （资料性附录） 部分已获认可的标准菌株提供者名录 美国标准菌种收藏所（American Type Cultrure Collection，ATCC） 国立标准菌种收藏所(National Collection of Type Cultures，NCTC) 中国医学菌种保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC） 中国普通微生物菌株保藏管理 （China General Microbiological Cultrure Collection Center，CGMCC） 中国药学微生物菌种保藏管理中心（China Pharmaceutical Culture Collection, CPCC)、 中国兽医微生物菌株保藏管理中心（China Veterinary Culture Collection Center，CVCC） 中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC) DB51/T 21692016 7 B B 附 录 B （资料性附录） 标准菌株制备流程图 B.1 由标准菌株（0 代）制备工作菌株和标准储存菌株 保存 获得标准菌株（0 代）依据说明书要求复苏（1 代）平板分离（2 代） 确认菌株的纯度和特性 符合挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液分装冻存或冻干 标准储存菌株（2 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（3 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（4 代） 工作菌株（5 代） 销毁 挑取纯菌落转种斜面并培养 否 是DB51/T 21692016 8 B.2 由标准储存菌株（2 代）制备储备菌株和工作菌株 迅速解冻 标准储存菌株（2 代）符合 挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液在非选择性平板上转种并培养 销毁 分装冻存或冻干 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（5 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 在非选择性平板上转种并培养 验证菌株的纯度和形态（3 代） 验证菌株的纯度和形态（3 代）符合工作菌株（4 代） 否 否 是 是迅速解冻 在非选择性平板上转种并培养 验证菌株的纯度和形态（4 代） 符合挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（5 代） 储备菌株（3 代） 是否 销毁 DB51/T 21692016 9 参 考 文 献 1 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 2 SN/T 1538.1培养基制备指南实验室培养基制备质量保证通则 3 SN/T 1538.2培养基制备指南培养基性能测试实用指南 4 WS/T 232 商业性微生物培养基质量检验规程 _ DB51/T 21692016