第3章-从活细胞中纯化DNA.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 从活细胞中纯化,DNA,3.1,全细胞,DNA,的制备,3.1.1,细菌培养物的生长和收集,确定成分的培养基,(defined medium),，,M9,不确定成分的培养基,(undefined medium),，如,LB,蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段,酵母提取物：提供氮源，糖类以及其它有机与无机营养,3.1.2,细胞提取物的制备,细菌细胞的屏障,:,细胞膜和细胞壁,物理方法与,化学方法,化学方法,:,溶菌酶,(,消化细胞壁多聚物,),EDTA(,螯合钙离子,抑制,DNA,酶的活性,),SDS:,去污剂,协助细胞壁的裂解,3.1.3,从细胞提取物中纯化,DNA,降解杂质,留下,DNA(,苯酚与氯仿的混合物,RNA,酶,),离子交换层析,分离,DNA(,带正电荷的离子交换剂,),3.1.4 DNA,取样的浓缩,乙醇沉淀,(,破坏了,DNA,分子间的氢键,),3.1.5 DNA,浓度的测量,A,260,/A,280,=1.8,3.1.6,制备全细胞,DNA,的其它方法,植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到,1.5ml,离心管,加,650,l,在,65,度预热的,CTBA,提取液,水浴锅中,65,温浴,40,分钟后取出，静置冷却,加入,650l,苯酚：氯仿（,1,：,1,）混合液，上下颠倒混匀，静置,5,分钟,12000rpm,离心,10,分钟,取上清液，加入,2l,（,10mg/ml,）,Rnase,37,度水浴,30,分钟,再抽提一次,取上清液，加入,2,倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇,轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或,6000rpm,离心,5,分钟,70%,的乙醇洗后，凉干,。,3.2,质粒,DNA,的制备,3.2.1,基于分子大小的分离,3.2.2,基于构象的分离,质粒有三种构型,cccDNA,(,共价闭环,DNA),：,DNA,的两条链都是完整的。,ocDNA,(,开环,DNA),：,只有一条链是完整的。,线性,DNA,：,DNA,的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒,DNA,。,但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解,。,超螺旋,DNA,松弛,cccDNA,开环,DNA,核酸内切酶,DNA,连接酶,核酸内切酶,DNA,促旋酶,拓扑异构酶,碱,变性,用,CsCl,-EB,等密度离心,U,pper band containing chromosomal DNA and open,plasmid,circles,Lower,band of covalently closed circles,plasmid,DNA,Ethidium,bromide(EB),包含质粒的细胞,用溶菌酶弱化细胞壁，用,NaOH,和,SDS,溶液裂解,变性的染色体,DNA,用,acidic sodium acetate,中和,染色体,DNA,复性 形成不溶的网状物,高浓度的,acidic sodium acetate,使,protein-SDS,复合物和高分子量的,RNA,沉淀,ccc,DNA,不发生变性，以天然状态溶解在溶液中,通过离心去除沉淀,通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀,，或用,凝胶过滤方法纯化质粒,DNA。,3.3,噬菌体,DNA,的制备,噬菌体颗粒释放在培养物物中,离心后,细菌聚集在管底,收集噬菌体,分离衣壳蛋白与,DNA,3.3.1,培育培养物获得高,噬菌体校价,够量的细菌,(,寄主,),细胞,够量噬菌体,溶源周期向裂解周期的转化,c,I,温度敏感型突变体,p43,3.3.2,非溶源性,噬菌体的制备,基因工程用,噬菌体载体被敲除了,c I,基因，需要在培养物细菌的密度与接种体的大小之间获得正确的平衡（图,3.20,）,3.3.3,从被浸染培养物中收集噬菌体,加入,PEG,能够吸收水分,使噬菌体颗粒大分子沉淀,3.3.4,从,噬菌体颗粒中纯化,DNA,3.3.5 M13,噬菌体,DNA,的纯化带来的几个问题,M13,噬菌体双链复制,类似质粒,M13,噬菌体单链包装形成成熟的噬菌体分泌到培养基中,.,培养收集（上清）,PEG,沉淀噬菌体缓冲液重悬苯酚除去衣壳蛋白收集水相加入乙醇沉淀,M13DNA,重悬,