第二章-蛋白质的定性定量分析课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章,蛋白质的定性定量分析,蛋白质定性分析,(qualitative analysis),确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质,蛋白质定量分析,(quantitative analysis),确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量,蛋白质含量的测定方法,（重点掌握）,蛋白质相对分子量测定,(SDS-PAGE),等电聚焦电泳,(IEF),（,一般了解）,蛋白质的免疫印迹分析,(western blot),蛋白质元素组成的特点,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为,16,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此,只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据,以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%),=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,一、紫外光谱(A,280,)吸收法,这一方法可用来快速检测溶液中是否含有,蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋,白质的洗脱峰,原 理,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在,280 nm,附近,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液,280 nm,的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法,芳香族氨基酸的紫外吸收,优 点,快速,缺 点,核酸可引起强干扰作用,芳香族氨基酸含量差异可以起误差,对蛋白质无破坏性,不是严格的定量，适用于测定蛋,白质粗提液,二、考马斯亮蓝G-250检测法,这是一种迅速、可靠的通过染色法测定,溶液中蛋白质含量的方法,所需时间,10 min,优 点,快速（反应时间仅需,2 min,）,敏感，几乎没有蛋白质损失,缺 点,用这种测定方法对蛋白质引起不,可逆的变性,对各种纯化蛋白质反应不同,三、Lowry检测法,这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.,原 理,首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在,745 750 nm,处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据,750 nm,的光吸收值大小计算蛋白质的含量,优 点,一种可靠的蛋白质定量方法,不同蛋白质之间差别很小,缺 点,某些试剂不稳定,干扰物质多,使蛋白质发生不可逆变性,计算方法,标准曲线法,注意事项,在加入试剂,30 min,后呈色达到饱,和，时间延长颜色信号减弱,许多干扰物质降低颜色反应,高,盐,浓度可引起沉淀,四、BCA(二喹啉甲酸)检测法,这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法,优 点,检测敏感性高,缺 点,蛋白质发生不可逆的变性,终产物稳定,巯基试剂和去垢剂干扰,第二节 蛋白质相对分子量测定,分子量测定(molecular weight,MW),排阻层析,沉降平衡超速离心,动态弹性光散射,孔径梯度电泳,质谱(ESI-MS),3.SDS-PAGE基本原理,SDS,影响迁移率的因素,十二烷基,硫,酸钠,(Sodium,Dodecyl,Sulfate),十二烷基,磺,酸钠,(,Sodium,Dodecyl,Sulfonate,),SDS作用：,与蛋白牢固结合，当其浓度大于,1 mmol/L,时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有,相同密度的负电荷,，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异,4.SDS-PAGE测定分子量的操作,标准品的选择及处理,待测样品的制备,电泳分离及染色,相对迁移率的计算,Watch SDS-PAGE操作,Analysis for SDS-PAGE electrophoresis,5.注意事项,选择合适的胶浓度,样品中高浓度的阳离子可能会导致,SDS,的沉,淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去,SDS,与蛋白质之间的结合程度,蛋白质的分子量范围,15,200 KD,之间,二,硫键,是否完全被还原,溶液中,SDS,的浓度,溶液的离子强度,二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量,1.基本原理,2.凝胶过滤测定分子量的操作,分子筛效应,洗脱体积与相应分子量的关系,装柱,平衡,加样,平衡,洗脱,收集样品并计算,V,e,绘制标准曲线,3.注意事项,柱床表面不能干燥,凝胶的选择,Sephadex,溶胀,G,值的意义,凝胶柱的再生与保存,第 三 节,等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,等电点,(isoelectric point,pI),两性电解质性质,支持介质,(supporting media),Figure of IEF,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,Isoelectric Focusing,ReadyStrip,TM,IPG Strips,310,47,36,58,710,310NL,3.95.1,4.75.9,5.5-6.7,6.3-8.3,High-purity monomers,Narrow ranges for resolution of,low-abundance proteins,Overlapping gradients for“cyber gels”,Three lengths,-7 cm,11 cm and 17 cm,-0.5 mm x 3.3 mm,Broad Range,pH 3-10,Narrow Range,pH 4-7,Micro Range,pH 4.7-5.9,3,10,4,4,7,7,4.7,5.9,4.7,5.9,注意事项,两性电解质的选择,电极缓冲液,对样品的要求,样品必须无盐,加样的量要适当,加样方法,加样位置,第四节,蛋白质的免疫印迹分析,印迹技术(blotting),是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术,1975年，,Edwen Southern,提出了,分子印迹(渍),的概念,目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测,印迹技术的类别及应用,DNA,印迹技术,(,Southern,blotting),用于基因组,DNA,、,重组质粒和噬菌体的分析,RNA,印迹技术,(,Northern,blotting),用于,RNA,的定性定量分析,蛋白质的印迹分析,(,Western,blotting),用于蛋白质定性定量及相互作用研究,由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术,(,immunoblotting,),一、免疫印迹分析的应用,对蛋白质进行定性分析,对蛋白质进行半定量分析,信号转导分析,生物大分子相互作用分析,将蛋白质固定在膜上的其他应用,结构域分析,斑点印迹,抗体纯化,为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原,蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析,二、免疫印迹分析的基本流程,电泳分离蛋白,转移至固相膜,封闭非特异结合位点,与第一抗体温育反应,与第二抗体交联物温育反应,显色,制备蛋白样品,蛋白质转移,抗体检测,免疫印迹操作流程图,1.样品的制备,组织或细胞中提取,裂解,去污剂,(SDS,、,Triton X-100,、,NP-40,、,Tween-20,),蛋白酶抑制剂,(,PMSF,、,EDTA,、,Pepstatin,、,Leupeptin,、,Aprotinin,),蛋白质的定量,(,Bradford,、,BCA,、,Lowry),基因工程表达重组产物,2.电泳分离,SDS-PAGE,非,变性,PAGE,EIF,3.蛋白质的电转移,方法：半干法、,湿法,作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,注意：,在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡,！？,常用的蛋白质转移膜,种类 微孔大小 结合能力 特点,NC膜,0.45 um,80-100 ug/cm,2,应用广泛,20kD,易丢失,PVDF膜,0.22 um,0.45 um,80-100 ug/cm,2,170-200 ug/cm,2,20kD,不易丢失,容量大、强度高,尼龙膜,480 ug/cm,2,用于核酸,电转移装置,电转移示意图,电转移装置,4.靶蛋白的免疫学检测,封闭,对转移膜上的潜在结合位点进行封闭，,防止抗体非特异性结合在膜上，,降低背景颜色,BSA、脱脂奶粉,靶蛋白与第一抗体反应,单抗、多抗,注意：,设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等,作用：排除假象,与第二抗体反应,第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记,酶标抗体常用酶：,碱性磷酸酶,(alkaline phosphatase，AKP),辣根过氧化物酶,(horseradish peroxidase，HRP),胶体金标记、,125,I标记标记,显色,AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸,(bromochloroindolyl phosphate，BCIP),与氮蓝四唑,(niro-blue tetrazolium，NBT),发生反应，产生深蓝色化合物，显示出蛋白质所在的位置。,Watch procedure,HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋白质所在的位置,四、免疫印迹注意事项,SDS-PAGE,凝胶的浓度,膜的选择,电转移（,方向,、,电流,、,转移效率,）,充分封闭和洗膜,抗体的使用（,稀释比例,、,分装,）,免疫检测（,显色,）,