微生物学第四章-酶的分离纯化公开课课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第四章 酶的分离纯化,及产品成型,2/14/2026,第四章 酶的分离纯化及产品成型,重点,（,2,）酶的分离纯化：沉淀分离、离心,分离、膜过滤、层析分离、电泳分离,（,4,）酶纯化过程,的纯度监测,本章知识点：,（,1,）细胞的破碎、酶的提取,（,3,）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型,一、生物下游加工技术,下游加工过程,包括目标产物的提取、浓缩、纯化及,成品化等过程。,大多数酶,的回收纯化过程成本约占,70%,；,医用酶,的生产回收过程的成本高达,85%,；,基因工程表达产物,的回收纯化过程成本一般占,85-90%以上,；,青霉素,回收过程成本约占,50%,；,乙醇,的回收过程成本仅占,14%,。,二、分离纯化的一般流程,发酵液,细胞分离（离心、过滤）,细胞,清液,细胞破碎,碎片分离,粗分离,纯化,成品化,线路2,线路1,（胞内酶）,（胞外酶）,预处理,发酵液,预处理,细胞分离,细胞破碎,细胞碎片分离,初步分离,纯化,成品加工,（胞外酶）,酶分离纯化方法,离心分离、凝胶过滤、膜分离,盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、,等电点沉淀,离子交换层析、电泳分离、等电聚焦,选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法,亲和层析、免疫电泳、免疫沉淀,分离依据的性质,分离方法,分大小、轻重,溶解度大小,稳定性差异,电荷性质,亲和作用,发酵液,预处理,细胞分离,细胞破碎,细胞碎片分离,初步分离,纯化,成品加工,（胞外酶）,第一节 酶的提取分离（酶溶液的制备）,方法：,（1）加热,适用于耐热的酶，加适当的酶保护剂。,（2）加凝聚剂或絮凝剂,（3）调pH值,一、发酵液的预处理,目的：,降低粘度，便于固液分离。,发酵液,预处理,细胞分离,细胞破碎,细胞碎片分离,初步分离,纯化,成品加工,（胞外酶）,二、细胞破碎,只对胞内酶,（1）机械破碎法,（2）物理破碎法,（3）化学破碎法,（4）酶促破碎法,超声波,细胞破碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,电动玻璃匀浆机,利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。,组织捣碎机,，,细胞研磨器,，,匀浆器等,。,（一）机械破碎法,高压匀浆器,细胞悬浮液,加工后的细胞匀浆,阀座,碰撞环,阀杠,珠磨机,通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织细胞破碎的方法。,冻融法,、,压差法,、,超声波法,。,（二）物理破碎法,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法。,有机溶剂,：如甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等。,非离子型表面活性剂,：吐温、催通等。,（三）化学破碎法,微生物种类,酶,细菌,酵母,霉菌,植物细胞,（四）酶促破碎法,（1）自溶法,（,自身酶）,（2）酶处理,（外加酶）,溶菌酶,-葡聚糖酶,几丁质酶,纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶,机械破碎,捣碎法,研磨法,匀浆法,物理破碎,温度差破碎法,压力差破碎法,超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂,表面活性剂,酶促破碎,自溶法,外加酶法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏,细胞破碎方法及其原理,三、酶的提取,指在一定的条件下，用适当的,溶剂,处理含酶原料，使,酶,充分,溶解,到溶剂中的过程，又称抽提。,原料,溶剂,酶,（一）提取方法,四稀：,稀盐,、,稀酸,、,稀碱,、,稀有机溶剂,，水。,提取方法,提取对象,稀盐溶液,稀酸溶液,稀碱溶液,稀有机溶剂,在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶,在稀酸溶液中溶解度大且稳定的酶,在稀碱溶液中溶解度大且稳定的酶,与脂质结合牢固或含较多非极性基团的酶,（二）提取过程中的注意事项,不超出酶的,酸碱稳定范围,；,最好,远离,待提取酶的,等电点,。,010左右，尤其是采用有机溶剂提取时。,3、提取液体积（用量）：,为含酶原料体积的25倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。,提高酶的稳定性。,1、pH值：,2、温度：,4、加保护剂：,第二节 酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术,盐析沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,聚乙二醇沉淀法,复合物沉淀法,一、沉淀分离法,（一）盐析沉淀法,常用中性盐：,（NH,4,）,2,SO,4,优点：,溶解度大，温度系数小；,价廉易得；,可保护酶。,1、盐析操作,（1）硫酸铵的饱和度,100%,（NH,4,）,2,SO,4,的饱和度（%）=,实际浓度,饱和浓度,0.4 S=40%（饱和度）,（2）调整盐浓度的方法,加饱和（NH,4,）,2,SO,4,溶液：,V,V,0,（S,2,-S,1,）,1-S,2,=,V,0,原来溶液的体积,V 所需加入饱和硫酸铵的体积,S,1,原来溶液的硫酸铵饱和度,S,2,所需达到的硫酸铵饱和度,例：将2升0.2S的硫酸铵溶液提升至0.5S，需加饱和硫酸铵溶液多少升？溶液体积增加多少倍？,加固体（NH,4,）,2,SO,4,：,W,B（S,2,-S,1,）,1-AS,2,=,W 将,1L,饱和度为S,1,的溶液提高到 S,2,所要添加的固体硫酸铵,克,数；,A、B 与温度有关的经验常数,例：某酶制剂厂生产蛋白酶发酵液20吨，要求硫酸铵的饱和度达到40%，计算需要加入硫酸铵多少kg?（25）,经验常数,0,10,20,25,30,A,0.271,0.281,0.290,0.294,0.298,B（g/L）,514.72,525.05,536.34,541.24,545.88,（mol/L）,3.09,3.97,4.06,4.10,4.13,加入饱和硫酸铵溶液,溶液体积不大，要达到的盐浓度不高,加入固体硫酸铵,当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高,2、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素：,（1）,不同酶,，盐析时所需的,盐浓度,各不相同。,（2）加盐操作时，防止,局部盐浓度过高,，防止产生,泡沫,。,（3）,pH值,和,温度,：等电点附近，室温或低温操作。,（5）,脱盐,：超滤、透析或层析。,（4）,蛋白质浓度,：一般控制在2.53.0%为宜。,（二）有机溶剂沉淀法,1、作用原理,去水膜；,降低介电常数；,破坏氢键。,2、操作注意,低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。,（三）等电点沉淀,1、原理,2、实际操作,与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。,单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。,3、注意,加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。,（四）选择性变性沉淀法,1,、,热变性法,：,根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。,2,、,酸碱变性法：,目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整,pH,使杂蛋白变性沉淀。,选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等,杂质,变性沉淀，而不影响所需的酶。,第二节 酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术,盐析沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,选择性变性沉淀法,第二次作业：,1、设计一套详细方案，从自然界中筛选产蛋白酶的微生物菌种。,二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用,借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。,二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用,膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。,广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。,渗出液,膜,分离技术的地位和影响,美国官方文件曾说,“,18世纪电器改变了整个工业进程，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”,日本,和欧洲,则把膜技术作为,21世纪的基盘技术进行研究和开发,。,“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”,-Norman N.Li,，,美国科学院院士，著名华裔科学家。,膜分离已得到广泛应用,。,21,世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。,（一）膜分离的类型,渗透（Osmosis）,透析（Dialysis）,微滤（Microfiltration）,超滤（Ultrafiltration）,纳滤（Nanofiltration,）,反渗透（Reverse Osmosis）,1、按推动力不同：,（2）压力差膜分离：,（3）电位差膜分离：,（1）扩散膜分离：,电渗析（Electrodialysis）,2、按膜孔径或截留物质的大小：,微滤 超滤 纳滤、电渗析、透析,反渗透,膜孔径,大,小,灰尘,细菌,病毒,生物大分子,生物小分子,盐类,水,请将下列物质按从大到小的顺序排列：,病毒,生物大分子,生物小分子,盐类,水,灰尘,细菌,病毒,生物大分子,生物小分子,盐类,水,灰尘,细菌,病毒,生物大分子,生物小分子,盐类,水,灰尘,细菌,病毒,生物大分子,生物小分子,盐类,水,膜,微滤（MF）,超滤（UF）,纳滤（NF）,反渗透滤（RO）,灰尘,细菌,（0.2-2um）,（10-200nm）,（2nm）,（2-10nm）,各种膜分离法的原理和应用范围,膜分离法,截留的颗粒大小,截留的主要物质,过滤介质,应用举例,微滤（MF）,0.22um,灰尘、细菌,微孔滤膜,除菌，回收菌,超 滤（UF）,10nm200nm,生物大分子及以上,超滤膜,蛋白质、多肽和多糖的回收和浓缩,纳 滤,（NF）,2nm10nm,生物小分子及以上,纳滤膜,脱盐、浓缩,反渗透,（RO）,2nm,盐类及以上,反渗透膜,盐、氨基酸、糖的浓缩、淡水制造,1、微 滤(MF),又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。,（1）操作压力：,低于0.1 MPa。,（2）应用：,实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵液中的细胞。,无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药物和营养物质的过滤除菌等。,（二）酶分离纯化中几种常见的膜分离技术,细胞,水,盐,大分子,小分子,2、超 滤(UF),可截留溶液中溶解的,大分子,物质，而透过,小分子,物质。,（1）操作压力：,0.10.7MPa。,（2）应用：,一是分离纯化，使高分子物质与低分子物质分离；,二是溶液的浓缩。,大分子,水,盐,小分子,纳滤膜主要用于截留粒径在,210nm,，,分子量,为1000左右,的物质，可以使,盐,和,小分子,物质透过，,操作压（0.51MPa）,。,3、纳 滤(NF),水,盐,小分子,大分子,4、反渗透(RO),在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻挡于膜壁外。,（1）操作压力：,0.713 MPa。,（2）应用：,在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。,溶质,水,水,膜,溶质,水,水,膜,渗透,反渗透,5、电渗析,在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离的目的。,酶液,膜,膜,+,-,+,-,应用：,电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海,水淡化、纯水制备等,透析袋,酶溶液,蒸馏水,应用：,主要用于生物大分子溶液的,脱盐,。,不适于大规模,生物分离过程。,6、透析,盐类,水,膜,透析,水,膜,渗透,1、若除去酶溶液中的盐分，可采用下面哪种分离方式？（）,A.板框过滤 B.微滤 C.超滤 D.反渗透,2、若除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪种分离方式？（）,A.板框过滤 B、微滤 C.超滤 D.反渗透,3、在采用微生物发酵生产壳聚糖酶时，若采用膜过滤的方法除去发酵液中的菌体细胞，可采用哪种膜分离方式？,用生产所得的壳聚糖酶来降解壳聚糖生产壳寡糖时，反应完成后，可采用哪种膜分离方法除去反应液中的壳聚糖酶？,练习：,三、膜分离技术的基本流程,渗出液,膜组件,料液罐,浓缩液（回流液）,泵,中空纤维超滤器,中空纤维膜分离装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。,每根中空纤维内腔直径为,0.2mm,。,四、生产中常用的膜分离装置,中空纤维超滤膜组件,清洗液,清洗液出口,渗出液,渗出液,（c）,五、膜及膜的使用性能,（一）膜的结构,膜,表层：,孔径各异，厚度为0.15 um,基层：,起支持作用，厚度为50250 um,主要有：,陶瓷,、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。,适用：,微滤膜,。,特点：是机械强度高，耐高温、耐化学试剂和耐有机溶剂，但,缺点,是不易加工，造价较高。,1、无机材料,（二）制膜材料,目前，实用的有机高分子膜材料有：,纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类及其他材料,。,可用作,反渗透膜,、,微滤膜,和,超滤膜,。,2、有机高分子材料,（1）透水率（透水通量、流率）：,是指在一定温度和压力条件下单位膜面积在单位时间内透 过的水量。,处理蛋白质（酶）溶液时，透水率常为纯水的,10%,。,（2）截留率：,是指溶液中某一溶质被膜截留量的百分数。,酶超滤浓缩通常选用,90%,以上截留率的膜。,（3）截留物相对分子质量：,是指某种大分子如酶，在截留率达到某一指标情况下的被截留物的分子量。,（三）膜的使用性能,