实验四-蛋白质的性质实验(一)课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 蛋白质的性质实验(一),蛋白质及氨基酸的呈色反应,一、目的：,1了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。,2了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。,3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。,二、呈色反应：,（一）双缩脲反应,1原理：,尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu,2+,结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。,双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个CSNH,2,，CH,2,NH,2,，CRHNH,2,，CH,2,NH,2,CHNH,2,CH,2,OH或CHOHCH,2,NH,2,等基团,NH,2,NH,2,以及乙二酰二胺（OCCO）等物质也有此反应。NH,3,也干扰此反应，因为NH,3,与Cu,2+,可生成暗蓝色的络离子Cu（NH,3,）,4,2+,。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。,2试剂：,尿素,10%氢氧化钠溶液,1%硫酸铜溶液,2%卵清蛋白溶液,3操作：,取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。,向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。,（二）茚三酮反应,1原理,除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。,丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。,该反应十分灵敏，11 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。,茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO,2,、NH,3,和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。,2试剂：,蛋白质溶液,2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清水=19）,0.5%甘氨酸溶液,0.1%茚三酮水溶液,0.1%茚三酮-乙醇溶液,（三）黄色反应,1原理：,含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。反应式如下：,2试剂：,鸡蛋清溶液,将新鲜鸡蛋的蛋清与水按120混匀，然后用6层纱布过滤。,头发,指甲,0.5%苯酚溶液,浓硝酸,0.3%色氨酸溶液,0.3%酪氨酸溶液,10%氢氧化钠溶液,3操作：,向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。,管 号,1,2,3,4,5,6,7,材 料,（滴）,鸡蛋清,溶液,4,大豆,提取液,4,指甲,少许,头发,少许,0.5%,苯酚,4,0.3%,色氨酸,4,0.3%,酪氨酸,4,浓硝酸/（滴）,2,4,40,40,4,4,4,现象,(四)坂口反应,原理:,2NH,3,+3NaBrO N,2,+3H,2,O+3NaBr,2.试剂,1.0.3%精氨酸溶液 10毫升,2.蛋白质溶液 100毫升,3.20%氢氧化钠溶液 100毫升,4.1%-萘酚乙醇溶液 20毫升,5.次溴酸钠溶液 10毫升,2克溴溶于100毫升5%氢氧化钠溶液中.置棕色瓶中，可在冷暗处保存两周,3 操作方法,向各试管中按下表加入试剂，记录出现的现象,本实验十分灵敏。-萘酚过量。次溴酸钠、精氨酸及蛋白质均不可过量，过量的次溴酸钠可继续氧化有色产物使颜色消失。,试剂,管号,H,2,O,0.3%,精氨酸,蛋白质溶液,20%,NaOH,-萘酚,NaBrO,现象,1,_,_,5,5,3,1,2,4,1,_,5,3,1,3,5,_,_,5,3,1,2.试剂,1.蛋白质溶液 50毫升,鸡蛋清:水=1:1,2.0.3%半胱氨酸溶液 5毫升,3.10%氢氧化钠溶液 100毫升,4.浓盐酸 100毫升,5.0.5%醋酸铅溶液 50毫升,6.醋酸铅试纸:用10%醋酸铅水溶液浸泡滤纸后晾干,