第六章酶、细胞、原生质体固定化.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 酶、细胞、原生质体固定化,1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。,2.不能回收利用。,3.产物的分离纯化困难。,改善方法：固定化生物技术,游离酶的缺点：,一、定义及特点,1.固定化酶(immobilized enzyme),固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。,第一节 酶、细胞、原生质体固定化,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶,（固定化酶）,固定化技术,优点：,(1)可提高稳定性。,(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。,缺点：,(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。,(2)酶活性下降。,2.固定化细胞（immobilized cell）,固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。,优越性：,(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;,(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系,完成部分代谢过程。,局限性：,(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的,副产物。,(2)只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞,外的产物,(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限,制作用。,依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。,1.吸附法（adsorption）,根据吸附剂的特点分:,1）物理吸附法（physical adsortion）,作用力：,氢键、疏水键,常用载体：,氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、,硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。,2）离子结合法（ion binding）,作用力：,离子键,常用载体：,DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-,纤维素,优点：,条件温和，操作简便，酶活力损失少。,缺点：,结合力弱，易解吸附,。,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）,优点：,酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。,缺点：,反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,3.交联法（crosslinking）,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。,双功能试剂：,常用的是戊二醛,O,O,H C CH,2,CH,2,CH,2,C H,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,此法与共价偶联法利用的均是共价键，,不同之处：,交联法不使用载体。,缺点：,(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。,(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,4.包埋法（entrapment）,将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：,网格型：,将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。,微囊型：,将酶包埋在高分子半透膜中。,1）,网格型包埋法,（gel(lattic)entrapment）,又称凝胶包埋法,凝胶,包埋条件,酶活性,强度,天然凝胶,琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶,温和,不变,差,合成凝胶,聚丙烯酰胺、光交联树脂,聚合反应,部分失活,高,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法：,滴至,海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl,2,溶液中 IE(or IC),角叉菜胶包埋法：,滴至,角叉菜胶E(or cell)KCl,溶液中 IE(or IC),聚丙烯酰胺凝胶包埋法：,AP及TEMED,Acr+Bis+E(or cell)IE(or IC),光交联树脂包埋法：,光交联树脂预聚物,+E(or cell),紫外照射,IE(or IC),2）微囊型包埋法,（microencapsulation）,又称半透膜包埋法,将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。,半透膜孔径80%活性。,（三）酶的最适温度,最适温度与酶稳定性有关。,多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上,升（有例外）。,（四）酶的最适pH,a.载体性质的影响,带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。,b.产物性质的影响,产物为酸性时，最适pH比游离酶高一些,产物为碱性时，最适pH比游离酶低一些,对于小分子底物，酶固定前后专一性基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。,（五）酶的作用专一性,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。,（1）细胞的存活率和稳定性提高。,（2）产率增加。,（3）最适温度和最适pH常保持不变。,二、固定化细胞的性质,乙酰-DL 氨基酸 L 氨基酸+乙酸,乙酰-D 氨基酸,第三节 固定化酶与固定化细胞的应用,一、在工业生产上的应用,1.,氨基酰化酶（,Aminoacylase）,世界上第一种工业化生产的固定化酶,酰化酶,泵,储,罐,反应产物,离心机,消旋反应器,固定化酶柱子,晶体 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala,A-D-Ala,2.葡萄糖异构酶,世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,二、固定化酶在医学上的应用,1.,消血栓：,纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。,酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。,用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,2.人工肾：,原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,酶传感器,固定化酶和电化学传感器的结合。,优点：,既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；,酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定,。,三、在分析检测中的应用,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极,。,葡萄糖酶电极,酶电极示意图,D葡萄糖O,2,D葡萄糖酸1，5内酯H,2,O,2,半透膜,酶胶层,感应电极,Glucose,Gluconic acid,Glucose oxidase,Oxygen,Hydrogen peroxide,Membrane,Electrode,根据反应中消耗的O,2,、生成的葡萄糖酸和H,2,O,2,的量，可以用氧电极、pH电极和H,2,O,2,电极来测定葡萄糖的含量。,1）酶传感器的原理,生物传感器,由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,生物识别元件,(Biological recognition element),是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,换能器(Transducer),将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系,。,酶传感器工作原理示意图,酶传感器,主要由,固定化酶膜和变换器,组成：,固定化酶膜：,选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；,变换器：,把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,2）酶传感器的应用,水质监测,用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。,从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物,。,德国研发的环境废水BOD分析仪,医疗方面,葡萄糖传感器和血糖测定仪,用葡萄糖氧化酶（,glucoseoxidase,GOD,）,制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,食品鲜度,鱼鲜度传感器,在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内,ATP,经酶解依次形成,ADP,、,AMP,、,IMP,、,肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用,K,值表示：,K=,肌苷,+,次黄嘌呤,/ATP+ADP+AMP+IMP+,肌苷,+,次黄嘌呤,+,尿酸,大多数鱼死后520h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。,将这三个步骤的三种酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。,当K20时，鱼极新鲜，可供生食。,K在2040之间为新鲜，必须熟食。,K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。,肉鲜度传感器,肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。,用,腐胺氧化酶,与,过氧化氢电极,构成多胺生物传感器，或用,单胺氧化酶膜,和,氧电极,组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。,(1)将适宜的酶与抗体或抗原结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原）；,(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶抗体抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。,2.酶联免疫测定,作业题：,1.概念：,固定化酶；固定化细胞,2.酶的固定化有几种方法？阐述其机理。,3.举一例说明固定化酶的应用？,4.简述固定化原生质体制备的两个阶段。,