组培实验室的设计.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第一章,植物组织培养实验室构建,第一节：商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备,主要内容：,实验室的设计,仪器设备和器皿用具,在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,一、实验室设计,组培实验室设计原则：,保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,组培实验室组成：,标准组织培养室包括,:,洗涤室（区）,制备室（区）,灭菌室（区）,储放室（区）,操作室（区）,培养室（区）,观察室（区）,药品室（区）,可以根据自己的实际条件进行合并,准备室,：,完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器,.,洗涤、灭菌室,：,完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。,卧式灭菌锅,无菌操作室（接种室）,：,主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。,接种室宜小不宜大，一般,7,8,平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。,要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装,1,2,盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。,接种室应设有缓冲问，面积,1m,2,为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。,超静工作台,酸度计,培养室,：,培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。培养材料放在由金属制成培养架上培养。培养架一般设,5,层，最低一层离地高约,lOcm,，,其他每层间隔,30cm,左右，培养架高,1,7m,左右。其长度根据日光灯长度而设计，如采用,40W,日光灯，则长,I,3m,，,30W,的长,lm,，,宽度一般为,60cm,。培养室最重要的因子是温度，一般保持在,2027,左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在,70%,80%,为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照,10-16h,，,也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。,细胞学实验室,该室用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。小型仪器设备有：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等,。,显微镜,显微镜,玻璃器皿及用具,玻璃器皿,培养用的：试管、三角瓶、培养皿等；,显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。,微孔过滤器（细胞过滤器）：激素用于灭菌。,一般用石棉滤膜,第二节：培养基及其配制,主要内容：,培养基的成分,培养基的种类、配方及其特点,培养基的配制,1,、培养基母液的配制,2,、培养基的配制,一、培养基的成分,大量元素,微量元素,氨基酸和有机附加物,植物激素（植物生长调节剂）,维生素类,凝固剂,大量元素（以,Ms,培养基为例,）,序号,化学式,化学名称,用量,mg/l,1,KNO,3,硝酸钾,1900,2,NH,4,NO,3,硝酸铵,1650,3,KH,2,PO,4,磷酸二氢钾,170,4,MgSO,4,.7H,2,O,硫酸镁,370,5,CaCL,2,.4H,2,O,二,氯化钙,440,微量元素（以,MS,培养基为例）,序号,化学名称,化学式,用量（,mg/l),1,碘化钾,KI,0.83,2,硼酸,H,3,BO,3,6.2,3,硫酸锰,MnSO,4,.4H,2,O,22.3,4,硫酸锌,ZnSO,4,.7H,2,O,8.6,5,钼酸钠,Na,2,MoO,4,.2H,2,O,0.25,6,硫酸铜,CuSO,4,.5H,2,O,0.025,7,氯化钾,CoCL,2,.6H,2,O,0.025,氨基酸和有机附加物（以,MS,培养基为例,）,序号,化学名称,化学式,用量,(mg/l),1,肌醇,C,6,H,12,O,6,.2H,2,O,100,2,甘氨酸,NH,2,.CH,2,.COOH,2,3,盐酸硫胺素,C,12,H,17,CLN,4,OS.HCL,0.1,4,盐酸吡哆醇,C,8,H,11,O,3,N.HCL,0.5,5,烟酸,NC,5,H,4,COOH,0.5,植物激素（植物生长调节剂）,1,、生长素类：,IAA,，,IBA,，,2,，,4-D,，,NAA,等。,2,、细胞分裂素类：,KT,，,6-BA,，,ZT,等。,3,、赤霉素类；,GA1-GA4,，,GA7,，,GA9-GA16,，,GA24,，,GA25,等,4,、脱落酸：,ABA,5,、,乙烯,6,、,PH,值：,5.6-5.8,培养基的种类、配方及其特点,按性质分,基本培养基：,MS,、,MT,（,Murashige,and,Tucher,）,White,完全培养基,基本培养基 其它成分（,激素、有机物质等）,按状态分,固体培养基；液体培养基。,按作用分：,诱导培养基；增值培养基、生根培养基。,按培养过程分：,初代培养基、继代培养基。,培养基配方及特点,参见课本,p1718,培养基的配制,母液（储备液）的配制与保存,培养基配制,Ms,母液（储备液）的配制与保存,成 分,用 量,(g/l),每升,培养基取用量,(ml),母液,1,（大量元素）,NH,4,NO,3,KNO,3,MgSO,4,.7H,2,O,CaCL,2,.2H,2,O,KH,2,PO,4,母液,2,（微量元素）,KI,H,3,BO,3,MnSO,4,.4H,2,0,ZnSO,4,.7H,2,O,Na,2,MoO,4,.2H,2,O,CuSO,4,.5H,2,O,CoCL,2,.6H,2,O,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,成 分,用量（）,每升,培养基用量（）,母液,3,（铁盐）,FeSO,4,.7H,2,O,Na,2,.EDTA.2H,2,O,.,.,母液,4,（维生素、氨基酸）,肌醇,烟酸,盐酸吡哆醇,盐酸硫胺素,甘氨酸,.,.,.,.,.,培养基的配制,1,、在洁净的不锈钢锅里放入,750ml,蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。,2,、加入储备液,1,，储备液,2,、各，按需要量加入植物激素。,3,、用蒸馏水定容到,1L,。,4,、,调,H,值。一般,.,5,、培养基的分装。,6,、包扎。,7,、培养基的高压灭菌。,培养基的灭菌,高温高压蒸汽灭菌：,121,，,1.1Kg/c,，,15-20,芬，时间过长，培养基成分易变性失效,过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类,第三节：外植体的选择与培养,主要内容：,外植体的选择,外植体的灭菌,外植体的接种和培养,外植体的成苗途径,污染的原因及预防措施,外植体的褐变及其防止措施,培养物的玻璃化现象及其预防措施,一、外植体的选择,1,、外植体,（,Explant,）,：,是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。,2,、外植体选择的要求,选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加实用性。,选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。,选择合适的大小：根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般在,0.5-1.0cm,之间。,选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料,外植体的类型,1,、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）,2,、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）,3,、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；,4,、花球和花蕾,5,、种子、根、块根、块茎、花瓣等。,二、外植体的灭菌,外植体的消毒是组培成功与否的第一关键步骤。,外植体的预处理：,对外植体进行修整,去掉不要的部分,在流水下冲洗干净,.,外植体的表面灭菌：,原则：,充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样,常用灭菌药剂的使用和效果,消毒剂,使用浓,/%,清除难易,消毒时,/min,灭菌效果,次氯酸钠,2,易,5-30,很好,次氯酸钙,9-10,易,5-30,很好,漂白粉,饱和溶液,易,5-30,很好,升汞,0.1-1,较难,2-10,最好,酒精,70-75,易,0.2-2,好,过氧化氢,10-12,最易,5-15,好,溴水,1-2,易,2-10,很好,硝酸银,1,较难,5-30,好,抗菌素,4-50mg/L,中,30-60,较好,常用的灭菌方法,(1),茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗,-75%,酒精浸泡,10-20min-,无菌水洗,2-3,次或,Naclo,或升汞溶液泡,10-15min-,无菌水洗,3-4,次,（,2,）果实和种子的消毒：自来水冲洗,10-30min-70%,酒精漂洗,-2%Naclo,液浸,10min-,无菌水,2-3,次,-,取出种子培养,（,3,）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗,-,纯酒精漂洗,-,升汞浸,5-10min,或,2%Naclo,液浸,10-15min-,无菌水洗,3,次,（,4,）花药的消毒：自来水冲洗,70%,酒精浸泡数秒钟,-,无菌水洗,2-3,次,-,漂白粉上清液浸,10min-,无菌水洗,2-3,次,消毒注意事项,表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。,在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料,3,次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。,与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。,若外植体污染严重则应先用流水漂洗,1,小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。,HgCl2,效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少,5,次。,三、外植体的接种和培养,（一）外植体的接种,-,无菌操作,是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。,外植体接种全过程,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡,5min,器械消毒,酒精灯灼烧,酒精擦拭培养皿,酒精擦拭,旋转灼烧,取外植体,接种,盖好瓶塞,修剪外植体,（二）外植体的培养,1,、光照,2,、温度,3,、湿度,4,、氧气,愈伤组织途径：,外植体的成苗途径,试管苗,外植体,愈伤组织,根、芽,芽,芽 根,如安祖花的组织培养就属此类途径,器官发生途径：,外植体经诱导后直接形成根和芽，进而形成完整的植物体。如茎尖培养。,胚胎发育途径：,外植体,胚状体（原胚期、球形胚期、,心形胚期、鱼雷形胚期、子叶期）,试管苗,50,年代末期，,Steward,等人从胡萝卜的韧皮部用液体培养基通过游离细胞的分化，获得了胚状体。据统计，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物已达,117,种，分属,43,科，,75,属。,培养基的激素成分和氮源影响胚状体的发生。有的植物可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼陀萝、水稻、小麦花药培养；有的植物需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、酸枣、桃等。,在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。,五、污染的原因及其预防措施,1,、污染：,植物组织培养过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养失败的现象,2,、污染的原因,一是病原菌污染（细菌、真菌）,二是外植体、培养基、培养器皿带菌,三是操作人员未遵守操作规程。,真菌污染,污染的预防措施,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有：,防止材料带菌,-,选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施；,防止用具带菌,-,器皿与金属器械灭菌；,操作室要处于无菌状态,-,工作室、培养室灭菌等；,操作人员要按照操作程序进行。,在培养基中加入抗菌素,分散接种,假设污染率为,95%,：,100,块材料，接种于,100,支试管，即,1,块,/,支,。,得率为：,P=,（,1-95%,）,100=5,块无菌材料,200,块材料，接种于,100,支试管，即,2,块,/,支,。,P1,（,2,污）,=95%95%=90.25%,P2,（,1,污,1,得或,1,得,1,污）,=2 95%5%=9.5%,P3,（,2,得）,=5%5%=0.25%,若得到,1,支试管的无菌材料，至少要接种：,1/0.25%=400,支，即接种,800,块材料，能得,2,块无菌材料。,若按,3,块,/,支,接种，需做,8000,支试管培养基，接入,2.4,万块材料，才能有,1,支试管的（得,3,块）无菌材料。,六、外植体的褐变及其防止措施,褐变,褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象,影响褐变的因素,植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变。,基因型：,外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻。,培养基的成分：培养基中,6,BA,或,KT,能促进褐变发生，而生长素类如,IAA,可减轻褐变发生。,材料转移时间：,褐变的防止措施,选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低,PH,值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变,连续转移,加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸；,加活性碳,加多胺类物质，如精胺、亚精胺,七、培养物的玻璃化现象及其预防措施,玻璃化现象及其产生原因,培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象,玻璃化现象的预防措施,适当控制培养基中无机盐浓度,适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度,适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度,增加自然光照，控制光照时间,控制好温度,改善培养皿的气体交换状况,在培养基中添加其他物质,培养阶段易出现的其他问题,白花苗,第四节：试管苗的驯化与移栽,主要内容：,1,、试管苗的特点,2,、试管苗的驯化,3,、试管苗的移栽,4,、提高试管苗移栽成活率的途径,试管苗的生态环境,1,、高温且恒温,2,、高湿度,3,、弱光照,4,、无菌,试管苗的特点,生长细弱，茎、叶表面角质层不发达茎、叶呈绿色，但叶绿体的光合作用较差,叶片气孔数目少，活性差,根的吸收功能弱,对逆境的适应和抵抗能力差,试管苗的驯化,驯化的目的：,驯化的原则：,驯化的方法：,试管苗的移栽,移栽驯化基质的选择,移栽的方法：,影响试管苗移栽成活的因素：,提高试管苗移栽成活率的途径,提高试管苗生根质量,加强移栽前炼苗,保证组培苗移栽基质质量,作好移栽前根系处理,湿度控制,温度控制,光照控制,思 考 题,1,、培养基的类型有哪些？,2,、培养基的主要成分有哪些？各有何作用？,3,、外植体的选择有什么要求？,4,、无菌操作有哪些方法？,5,、简述植物组织培养中褐变发生的原因及其防止措施。,谢谢大家,