第十二章高效液相色谱.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第 十二 章高效液相色谱,(,HPLC,),概述,高效液相色谱法,高效液相色谱法（,HPLC）,是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段,。,它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。,高效液相色谱法与经典液相色谱法,经典液相柱色谱装置,高效液相色谱仪,例：分离20种氨基酸,柱长：170,cm,柱径：0.9,cm,F：30,mL,/h,t,分离,:20,h,经典柱色谱,HPLC,t,分离,：1,h,经典液相色谱法,高效液相色谱法,（分析型）,固定相,一般规格,特殊规格,固定相粒度（,m,）,75500,320,固定相粒度分布,(RSD),2030%,5%,柱长（,cm,）,10100,1030,柱内径（,cm,）,25,0.10.5,柱入口压强（,kg/cm,2,）,0.011,20300,柱效,(,每米理论塔片数,),10100,10,4,10,5,样品用量（,g,）,110,10,-7,10,-2,分析所需时间（,h,）,120,0.050.5,装置,非仪器化,仪器化,高效液相色谱法与经典液相色谱法,气相色谱（,GC,）,高效液相色谱（,HPLC,）,应用范围,占有机物的,20%,占有机物的,80%,分离效果,高,更高,选,择,性,流动相是气体，只能选择固定相,流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。,温,度,高温,常温（分离效果好）,灵敏度,(g/ml),10,-12,10,-9,液相色谱与气相色谱的比较,液相色谱与气相色谱的比较,（,l）,气相色谱法分析对象只限于分析,气体和沸点较低的化合物,，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些,高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质,，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。,液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：,气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，,流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。,也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,液相色谱固定相,类型多,，如离子交换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。,液相色谱通常在,室温下操作,，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。,（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。,但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。,目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。,高效液相色谱法特点,适用范围广；,分离性能好；,分析速度快；,流动相可选择性范围宽；,灵敏度较高；,色谱柱可反复使用；,流出组分容易收集；,安全。,高速,高效,高灵敏度,类 型,主要分离机理,主要分析对象或应用领域,吸附色谱,吸附能，氢键,异构体分离、族分离，制备,分配色谱,疏水分配作用,各种有机化合物的分离、分析与制备,凝胶色谱,溶质分子大小,高分子分离，分子量及其分布的测定,离子交换色谱,库仑力,无机离子、有机离子分析,离子排斥色谱,Donnan,膜平衡,有机酸、氨基酸、醇、醛分析,离子对色谱,疏水分配作用,离子性物质分析,疏水作用色谱,疏水分配作用,蛋白质分离与纯化,手性色谱,立体效应,手性异构体分离，药物纯化,亲和色谱,生化特异亲和力,蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析,液相色谱的分类,应用,由于,HPLC,分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过,HPLC,来完成的。,右图是各种,HPLC,方法的应用范围及对象,极性增加,不溶于水,溶于水,非极性,离子,非离子极性,吸附,反向分配,分配,正向分配,离子交换,尺寸排阻,凝胶渗透,凝胶过滤,分,子,量,第一节,液相色谱柱效,一 液相色谱速率理论,可忽略,涡流扩散项,流动相传质阻力,分子扩散项,固定相传质阻力项,流动相传质阻力,流动相流速对板高的影响,小颗粒填料，填充均匀；,选择较低的流动相流速；,选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。,修正的速率方程：,提高柱效途径,二 液相色谱中的柱外谱带展宽,柱外谱带展宽又称“柱外效应”，系指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色谱峰展宽，柱效下降,。,可分为：,柱前展宽,主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。,可分为：,柱后展宽,主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度等都是克服柱后展宽的途径,第二节高效,液相色谱仪,一、高效液相色谱仪流程图,1,贮液罐,(,滤棒，可滤去颗粒状物质,),2,高压泵（输液泵）,3,进样装置,4,色谱柱,分离,5,检测器,分析,6,废液出口或组分收集器,7,记录装置,高压泵,流动相溶剂,废液,色谱柱,进样口,检测器,高效液相色谱仪流程图,一 高压输液系统,要求,输出压力高,平稳、脉冲小,流量稳定可调,耐腐蚀,注射泵,1,高压泵,恒流泵,特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关，如往复式柱塞泵、注射式螺旋泵；,恒压泵,是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，如气动泵。,往复式柱塞泵,注射式螺旋泵；,2,梯度洗脱装置,通过改变流动相的组成来调整组分的,k,值，改变分离因子,值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,适合于二元梯度,适合于多元梯度,等度洗脱与梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分离,加快分析速度；,改善峰形,减少拖尾;,可能引起,基线漂移,分配比变化范围宽的,复杂样品应采取,梯度洗脱方式分离,3,贮液瓶及流动相,1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。,2)适用于所选择的检测器。,3)化学惰性好，以免破坏固定相。,4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。,5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。,对流动相溶剂的一般要求,二,进样系统,取样和进样功能,手动和自动,要求：,密封性好,死体积小,重复性好,进样时对色谱系统的压力和流量波动小,二,进样系统,准备状态 进样状态,六通阀进样,装置,自动进样器,三,色谱柱,内径：,45,mm,，,柱长：,1050,cm；,柱填料粒径3,10,m,分离柱,干法,填料粒度20,m,时,湿法,颗粒20,m,时,色谱柱的填充,匀浆法装柱示意图,四,检测系统,溶质型,检测器,总体,检测器,示差折光,检测器,介电常数,检测器,紫外,检测器,荧光,检测器,电化学,检测器,1,紫外吸收检测器,(,a),可变波长紫外检测器,(,b),二极管阵列检测器,氘灯,光栅,流通池,测量光电二极管,参比光电二极管,2 二极管阵列检测器,两种检测器的色谱图,(,a)：,可变波长紫外检测器；,(,b)：,二极管阵列检测器,(,b),(,a),紫外检测器,灵敏度高，,精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。,一些常用溶剂的紫外截止波长,溶剂,CS,2,氯仿,四氢呋喃,苯,乙睛,甲醇,水,紫外截止波长,/,nm,380,245,212,210,190,205,187,3,荧光检测器,灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。,4,示差折光检测器,利用组分与流动相的折射率之差进行检测。,通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。,5 化学发光检测器,6,电化学检测器,电导检测器,安培检测器,7,质谱检测器,五,检测系统,脱气装置 梯度洗脱 再循环 恒温 馏分收集及处理,第三节分配色谱,分离原理,K,不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关,液液分配色谱,液液色谱,键和相色谱,通过物理吸附的方法将液相固定液涂在载体的表面,通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面,固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。,缺点,特点,固定液溶液流失,一、化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；,硅胶,为基体,，,利用硅胶表面的硅醇基(,Si,一,OH),与有机分子之间成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类,（1）,疏水基团,如不同链长的烷烃（,C,8,和,C,18,）,和苯基等；,（2）,极性基团,如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；,（3）,离子交换基团,如阴离子交换基团：胺基，季铵盐；阳离子交换基团：磺酸等。,键和类型,键合方法,（,l）,硅酸酯型（,Si,一,OR）,键合相，,适用于不含水或醇的流动相；,（,2,）硅氮型（,Si,一,N,=,）键合相，,可用于非极性或强极性的溶剂作流动相，当使用水溶液时，必须限制,pH,在,48,范围内；,（,3,）硅碳型（,Si,一,C,）,键合相，同硅氮型；,（,4,）硅氧烷型（,Si,一,O,一,Si,一,C,）,键合相，,具有热稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂，能在,70C,以下，,pH,在,28,范围内正常工作。,2.键合相色谱法分类,反相键合相色谱:,常用固定相：,C,18,分离对象,非极性,中等极性化合物,常用流动相,甲醇-水,乙腈-水,反相键合相色谱,疏溶剂分离机制,固定相极性 流动相极性,离子性键合相色谱,将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。,3.化学键合固定相的特点,（1）,传质快,（2）,寿命长,（4）,选择性好,（5）,有利于梯度洗脱；,存在着,双重分离机制,：,(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；,低覆盖率：吸附为主；,二、固定相流动相的选择,第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用,极性明显不同固定相。,第三，固定相的极性与分析物质的极性相匹配，,仅有流动相的差异使分析物质沿柱移动。,柱子的选择,第一，固定相的极性与分析物质的极性粗配，用,极性明显不同的流动相洗脱。,反相键合相色谱:,常用流动相,甲醇-水,乙睛-水,分离对象,非极性,中等极性化合物,通过调节水的含量，,可使保留因子,k,迅速变化,通过改变流动相的化学性质，,可使选择因子,迅速变化,反相色谱四溶剂系统,甲醇、乙腈、四氢呋喃、水,正相色谱四溶剂系统,乙醚、氯仿、三氯甲烷、正己烷,调节,k,调节,三、洗脱物的流出顺序,反相键合相色谱:,极性大的先流出，极性小的后流出,正相键合相色谱:,极性小的先流出，极性大的后流出,四、分配色谱的应用,通过改变流动相的组成，容易调节,k,反相键和相色谱的优点,用单柱和流动相就能分离非离子化合物、,离子化合物、可电离化合物,用便宜的水作为流动相的主体，以价格适宜,且易纯化的甲醇为有机改性剂,可以预言洗脱顺序,色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱,反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。,用反相液相色谱法，可以解决80%左右的液相色谱课题。,因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。,具体看表21-3,第四节液固吸附色谱,一 吸附色谱法,1,分离原理,K,ad,值越大，保留时间越长。,2,固定相,硅胶强极性,氧化铝弱极性,活性炭非极性,分子筛,强极性,高分子多孔微球,(,GDX),固体吸附剂,3,流动相,(,洗脱剂,),越大，,表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。,溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能,溶剂强度参数,硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯,流动相：,干燥正庚烷,1份水饱和的正庚烷,2份干燥正庚烷,水饱和的正庚烷,改变流动相的,组成可改变分离,的选择性,4,应用,具有,不同官能团的化合物,具有相同官能团，但数量不同的化合物,异构体,例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：,邻位,间位对位,邻硝基苯胺,间硝基苯胺,对硝基苯胺,适合分离的物质,第五节其他色谱分析,一 离子交换色谱法,阳离子交换树脂,阳离子交换,阴离子交换,1,分离原理,2,固定相,阳离子,：,SO,3,H(,强,),CO,2,H(,弱,),阴离子：,N,+,R,3,(,强),NH,2,(,弱),基质,合成树脂,纤维素,硅胶,离子交换剂,3,流动相,水相,缓冲液+有机改性剂,调节选择性的主要参数,盐种类及浓度,pH,值,各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：,用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快,4,应用,离子及可离解的化合物,如氨基酸、核酸、蛋白质等,二 尺寸排阻,(凝胶),色谱法,排阻色谱分离示意图,相对分子质量差别,大于,10,的化合物,才可以分离,1 分离原理,2,固定相,是一种经过,交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水）,凝胶,3,流动相,不采用改变流动相组成的,方法控制分离度,三、分离类型选择,四、,HPLC,的,应用,1.环境中有机氯农药残留量分析,固定相,：,薄壳型硅胶(37,50,m),流动相：正己烷,流 速：1.5,mL,/min,色谱柱：50,cm,2.5mm(,内径),检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相,：,十八烷基硅烷化键合相,流动相：20%甲醇,-,水 100%甲醇,线性梯度淋洗，2%/,min,流 速：1,mL,/min,柱 温：50,C,柱 压：70,10,4,Pa,检测器：紫外检测器,