northern杂交.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2013/4/21,#,Northern,技术,Northern,技术简介,Northern blot,是一种通过检测,RNA,的表达水平来检测基因表达的方法。,Northern blot,首先通过电泳的方法将不同的,RNA,分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段,。,Northern,blot,在,1977,年由斯坦福大学,James Alwine,，,David Kemp,和,George Stark,发明。,Northern blotting,实际上依照比它更早发明的一项杂交技术,Southern blot,（依据生物学家,EdwinSouthern,名字来命名）来,命名,.,步骤,检测高丰度,mRNA(,占,RNA,总量的,0.1%,以上提取总,RNA,即可,如果,mRNA,含量较少,可提,poly(A)+,RNA.,1.RNA,的提取,2.,甲醛,的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预,杂交,6.Northern,印迹杂交,7.,放射性自显影检测,步骤,按分子量的大小分离,RNA,检测,RNA,是否,降解,1.RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7,.,放射性自显影检测,步骤,转移前胶在,50mmol/L,的,NaoH,中浸,20min,胶在,20*SSC,中浸,40min,转膜方法,:,电转移法,真空,转移法,细,管虹吸印迹法,1.RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7,.,放射性自显影检测,步骤,核酸标记,同位素标记,(P),地,高,辛标记,探针,:,DNA,探针,cDNA,探针,RNA,探针,1,.,RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7.,放射性自显影检测,步骤,预杂交目的,:,用非特异性的,DNA,分子及其他高分子化合物封闭待测核酸分子中的非特异性结合位点,以减少杂交时的非特异性反应,.,1.RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7,.,放射性自显影检测,步骤,探针与,RNA,杂交,1.RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转,膜,4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7.,放射性自显影检测,步骤,在膜上压一张,X,线胶片,放,于含增感屏的暗盒里,零下,70,度放射自显影,24-48h(,暗室中操作,),1,.RNA,的提取,2.,甲醛的琼脂糖凝胶上,RNA,电泳,3.RNA,转膜,(,尼龙膜,),4.RNA,探针制备,5.,预杂交,6.Northern,印迹杂交,7,.,放射性自显影检测,注意事项,DEPC,处理试剂和仪器,虹吸法转膜时要防止有气泡,保鲜膜封闭凝胶四周,防止短路,.,应用,分析,DNA,的转录产物,mRNA,测定,mRNA,分子量的大小,