高效液相色谱法测定血清中维生素A、E、β胡萝卜素PPT_南华大学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱法测定血清中,维生素,A,、,E,、,-,胡萝卜素,南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心,一、原理,本实验应用,HPLC,法测定人血清中维生素,A,、维生素,E,及,-,胡萝卜素；,血清样品用有机溶剂处理、提取后经,HPLC,色谱柱分离，根据保留时间和峰面积,(,或峰高,),与标准比较，便可定性和定量。,二、操作方法,1,样品处理,血清样品在采血后立即离心，分离血清；,置,5ml,塑料试管中，充氮、密封，于,-40,保存备用。,在,5ml,棕色具塞玻璃离心管中，加入,0.25ml,血清、,1ml 10,邻苯三酚乙醇溶液、,0.5ml 60,KOH,，用氮气将管内空气置换，,37,水浴,1h,；,冷水浴,3min,后加入,5,NaCl,1ml,，己烷,/,乙酸乙酯,(9:1)3ml,，用氮气将管内空气置换，盖紧塞子，水平振荡器上振荡,5min(40,次,/min),；,将全部己烷,/,乙酸乙酯层转移至含,1,ml,双蒸水的试管中，涡旋振荡器上振荡,10s,；,精确吸取,2ml,已烷,/,乙酸乙酯层于另一,5ml,棕色具塞玻璃离心管中，氮气吹干，加入,350l,甲醇，轻混至充分溶解，充氮气置冰箱待检测。,2,工作曲线,分别取不同量的维生素,A,、维生素,E,的标准液，以乙醇稀释混匀成不同浓度的混合标准应用液，与样品同样处理；,-,胡萝卜素以氯仿配制成不同浓度的标准液，同样品一样处理；,分别以标准应用液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。,三、数据处理,将样品中三种待测组分平行测定的峰面积均值分别代入各自的工作曲线，求得测定样液中各自的含量,;,再乘以样品处理时的稀释倍数，即得到血清样品中维生素,A,、维生素,E,及,-,胡萝卜素的含量。,四、质量控制,配制标准液时：,若有条件应对配制好的标准稀释液维生素,A,、维生素,E,、,-,胡萝卜素,200,600nm,扫描，观察最大吸收峰的波长；,如果所用,HPLC,仪能作波长变换，则在测定组分的最大吸收波长下测定可取得较高的灵敏度。,吸取上清液时：,注意不可触及界面；,否则：,一方面会吸入水，影响分析和柱的分离能力；,另一方面，界面上的脂肪层可能会影响分析结果。,在测定中，可用标准血清进行质量控制，保证测定结果的可靠性。,标准血清至少要在测定开始和结束时各测定一次；,当样品较多时，可隔若干个样,(,如,12,个,),测定一次，最后取标准血清测定的平均值即可。,样品保存时间：,血清样品在本法的制备与贮藏温度下，可保存,6,个月不发生变化；,维生素,A,和维生素,E,的无水乙醇贮备液及应用液贮于冰箱,(2l0,),，分别可稳定,2,个星期和,1,个星期；,-,胡萝卜素遇光和氧会被迅速破坏，所以应临用新配，并注意避光保存。样品的提取液比较稳定，可以隔夜后进行分析。,五、思考题,维生素,A,、,D,、,E,的生理作用、缺乏表现及食物来源。,哪些,B,族维生素与能量代谢有关？,