土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课)...ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题2,微生物的培养与应用,一、课题背景,1,、,尿素,的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2,、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成,脲酶,CO(NH,2,),2,脲酶,+H,2,O,+CO,2,NH,3,3,、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌,、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，,某些真菌和放线菌。,4,、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一,.,研究思路,.,筛选菌株,.,统计菌落数目,.,设置对照,1,、实例：,启示,：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,原因,：因为热泉温度,70,80,0,C,，,淘汰了绝大多 数微生物只有,Taq,细菌被筛选出来。,DNA,多聚酶链式反应是一种在体外将少量,DNA,大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（,93,0,C,）的,DNA,聚合酶,。,要,分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条,件等；,方法：,抑制大,多数微生物不能,生长,造,成有利于该菌生长的,环境,结果：,培养一,定时,间后，该菌数,量上升，再通过平板稀释等方法对它进行,纯化培,养分离。,2,、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件,(,包括营养、温度、,pH,等,),，同时抑制或阻止其他微生物生长。,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,3,、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需,培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,思考,2,该培养基对微生物,（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是,。,具有,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以,尿素,作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4,、培养基选择分解尿素的微生物的原理,1,、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,（二）,.,统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,（比例计数法）,待测样品,等量的已知含量的红细胞,混匀,涂抹,测定：,红细胞数目,细菌数目,计算单位体积内的细菌数目,将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按,1,：,1,均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。,细菌,红细胞,【,补充,】,显微镜直接计数是测定微生物的方法。,举例：已知红细胞浓度为,M,个,/,mL,，从体积为,N,mL,的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞,W,个，大肠杆菌,Y,个，求,NmL,大肠杆培养液中大肠杆菌的个数,X,是多少？,X,N,M Y,W,(,个,),观察到的红细胞平均数,/,观察到的细菌平均数,红细胞含量,/,细菌含量,公 式,2.,间接计数法（,活,菌计,数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细,胞。,常用方法：,稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(C,V),M,其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30,300,的平板,上进行计数。,为使结果接近真实值可将,同一稀释度加到三个或三个以上的平皿,中，经涂布，培养计算出菌落平均数。,统计的菌落往往比活菌的实际数目,低,。,恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，,一,般以三个稀释度中的,第二个稀释,度所,出现的平均菌落数在,50,个左右为最好,。,如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计,3,个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算,教材,P22,计数法,直接计数法、,平板计数法、,比浊法、,膜过滤法,实例分析,P22,你认为哪个同学的结果更接近真实值？,你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,实例分析,P22,第一同学只涂布了一个平板，,没有设置重复组，因此结果不具有说服力。,第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是,其中,1,个平板的计数结果与,2,个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将,3,个平板的计数值用来求平均值,。,设,置对照的,主要目的,是,排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,。,（三）,.,设置对照：,实例：教材,P23,原因：土样不同，培养基污染或操作失误,(,或者是混入了其他的含氮物质,),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，,对照的设置是必不可少的,。,方案一：由其他同学用与,A,同学相同土样进行实验,方案二：将,A,同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与,A,同学一致，则证明,A,无误；如果结果不同，则证明,A,同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,菌落计数,配制土壤溶液,系列稀释,涂布平板与培养,根据图示,2,7,填写以下实验流程：,试验设计：,实,验的具体操作,.,土壤取样,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土,3cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,.,制备培养基：,制,备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,准备,牛肉膏蛋白胨培养基,和,选择培养基,将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为,对照,，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为,10,3,10,7,。每个稀释度下需要,3,个,选择培养基，,1,个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要,15,个选择培养基，,5,个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备,8,个,灭菌的试管和,1,个,灭菌的移液管。,应在火焰旁称取土壤,10g,。,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁,进行,分离不同的微生物采用不同的稀,释度,原因：,不,同微生物在土壤中含量,不同,目的：,保,证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的,平板,三,样品的稀释,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为,10,3,10,7,。每个稀释度下需要,3,个,选择培养基，,1,个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要,15,个选择培养基，,5,个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备,8,个,灭菌的试管和,1,个,灭菌的移液管。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：,土壤中各类微生物的数量（单位：株,/kg,）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为,2 185,万，放线菌数约为,477,万，霉菌数约为,23.1,万。,结论：,为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.,取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了,2,个或,2,个以上菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.,微生物的培养与观,察并计数,在,菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数,目。,选,取菌落数目稳定时的记录作为结果,，以,防止 因,培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培,养不同微生物往往需要不同培养温,度。,细菌：,30,37,培养,1,2d,放线菌：,25,28,培养,5,7d,霉菌：,25,28,的温度下培养,3,4d,。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在,30,300,的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对,3,个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,微生物的培养与观察,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,思考,在研究未知微生物时务必规范操作，,以防被,致病微生物,感染，实验后一定要洗手。,（六）鉴定,：筛选后必鉴定,鉴别培养基,：,加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存,1,、酚红培养基：,鉴定分解尿素的细菌。,原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,2,、伊红,美蓝培养基：,鉴定大肠杆菌。,原理：代谢产物与伊红,美蓝结合 菌落呈深紫色并带有金属光泽。,伊红,美蓝培养基,是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的,代谢产物与伊红,美蓝结合,，使菌落呈,深紫色并带有金属光泽,，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂,(EMB),上典型特征,三、操作提示,无菌操作,做好标记,制定计划,课题成果与评价,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。,牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目,，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（二）样品的稀释操作是否成功,如果得到了,2,个或,2,个以上菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致,本课题知识小结,:,课后练习,2.,提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照,厌氧菌的培养,方法进行实验设计。,六、例题解析,例,1,对细菌群体生长规律测定的正确的表述是,A,在液体培养基上进行,B,至少接种一种细菌,C,接种一个细菌,D,及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：,一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。,在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：,A,1.,对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）,A.,在液体培养基上进行,B.,至少接种一种细菌,C.,接种一个细菌,D.,及时补充消耗的营养物质,2.,使用选择培养基的目的是（）,A.,培养细菌,B.,培养真菌,C.,使需要的微生物大量繁殖,D.,表现某微生物的特定性,状与,其他微生物加以区别,3.,能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是,(),A.CO,2,和,N,2,B.,葡萄糖和,NH,3,C.CO,2,和尿素,D.,葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（）,A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶,B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值,C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）,A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质,C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,（09，宁夏，15分）,（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。,（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。,（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。,（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。,（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。,（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,答案:（1）温度 酸碱度 易培养 生活周期短,（2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构,（3）比例合适,（4）鉴定(或分类),（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生.,（6）灭菌,例,3,（,2005,年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。,青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是,，青霉素是青霉菌的,代谢产物。,在生产和科研中，常选用处于,期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，,和,比较稳定。,对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，,，再计算发酵罐中菌体的总重量。,异养需氧型,次级,对数,个体的形态,生理特性,称菌体的湿重,（称烘干后的重量）,解析：,青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。,