实验8 微丝染色及形态观察.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微丝染色及形态观察,目的要求,1,.,掌握微丝的染色方法。,2.,了解光镜下微丝的基本形态结构。,实验原理,真核细胞质中纵横交错的纤维网称为,细胞骨架,(,cell skeleton,),，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为,微管,(microtubule,MT),、,微丝,(microfilament,MF),和,中间纤维,(intermediate filament,IF),。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。,当细胞用,TritonX-100,溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。,应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。,微丝在细胞内的分布特征,实验用品,器具：,CO,2,恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。,材料：,盖玻片培养的成纤维细胞,试剂：,6,mmol,/L PBS,（,pH 6.5,）、,1,TritonX-100,溶液、,M-,缓冲液、,3,戊二醛固定液、,0.2,考马斯亮蓝染液、,DMEM,培养液。,实验步骤,1.,培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于,37,、,5%CO,2,的温箱中生长,24h,48h,。,2.,染色处理,（,1,）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用,PBS,洗,3,次（从盖玻片一角轻轻滴加,3,4,滴），洗去表面的培养液。,（,2,）抽提 吸弃,PBS,，加入,1%,Triton X-100,液,4-5,滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理,15min,（,3,）稳定 吸弃,Triton X-100,，立即用,M-,缓冲液轻轻地洗涤,3,次。,（,4,）固定 略晾干，在,3%,戊二醛液,中固定,10min,，再以,PBS,液洗,3,次，洗去固定液。,（,5,）染色 滴加,3-5,滴,0.2%,考马斯亮兰,染液染色,10 min,，然后小心的用自来水漂洗。,（,6,）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水,纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。,实验结果,光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列。,光学显微镜下微丝分布图,注意事项,1.,洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。,2,操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。,3,染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。,4,TritonX-100,抽提蛋白时，注意避免抽提时间过长而导致细胞结构的破坏。,作业与思考题,1.TritonX-100,液、,M-,缓冲液、戊二醛及考马斯亮蓝在本实验中所起作用？,2,微丝作图,.,