酶快速反应动力学(第一章).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶快速反应动力学,Kinetics of Fast Enzyme Reaction,第一章 绪论,Introduction to Enzyme Kinetics,酶反应的稳态动力学和瞬变动力学,酶反应动力学是解释酶反应机制具有代表性的方法。酶动力学包括,两个方面，即酶的稳态动力学（,Steady-state kinetics,）,和预稳态动力学,（,Pre-steady state kinetics,），,后者也叫瞬变动力学（,Transient,kinetics,）。,酶的稳态动力学的基本目标是对酶催化的总反应进行测量与分析，,只涉及底物与产物，而不考察酶分子本身。,预稳态动力学可以直接研究总反应中所包含的分步反应。研究者的,兴趣所在是酶分子本身所发生的变化或能够反映这种变化的变化上。,两种动力学方法各有其优缺点。稳态动力学由于所要求酶制剂用量,少，且不需要使用特殊的仪器设备，因而长久以来获得了广泛的应用。,这种方法的缺点在于研究人员所获得的信息是间接的，有时也是不确切,的。预稳态动力学由于测量快速反应，而需要特殊的仪器设备（例如，,停流装置）。它的优点是可以提供用来解释复杂反应机制的信息。应该,指出，两种方法是相辅相成的，对于研究酶反应来说都很重要。,从二十世纪,60,年代起，测量快速反应的技术发展很快，性能越来越好的,测量快速反应的装置（如，停流分光光度计等）被不断推出，这给研究,酶反应的瞬变动力学提供了很大的方便。,第一节 研究酶反应的历史,一,.Henri,的工作,Henri,在,1902,年发表了一篇论文。他首次引入了一个十分重要的概,念，既酶与底物符合物的概念，并把它用到速度方程的推导中。随后，,他讨论和阐述了重要的酶反应的动力学特征，涉及到三种酶反应：,1.,蔗糖转化酶,(,Invertase,),催化蔗糖的转化；,2.,淀粉酶,(Amylase),催化糊精的水解；,3.,苦杏仁酶,(,Emulsin,),催化水杨苷的水解。,对实验结果归纳成如下几个要点：,1.,当底物浓度低时，酶催化的水解速度随底物浓度的增加而增加；,当底物浓度高时，水解速度保持恒定。,2.,反应速度与酶浓度成正比；,3.,产物的加入引起反应速度的减少，在低底物浓度时，减少尤明,显。,上述实验结果可以用下面两种反应机制解释,机制,I:,(1.1.1),(1.1.2),机制,II:,(1.1.3),(1.1.4),如果考虑产物与酶结合生成,EP,，,那么要把下述平衡包括到上述每,一个机制中去，,(1.1.5),在上述两种机制中，,ES,符合物的形成是共同的，然而所起的作用,却是完全不同的。在机制,I,中，产物的形成是通过一个双分子过程（,1.,1.2,式），即酶与底物的碰撞。在此种情况下，,ES,符合物是无意义的，,它通过减少,E,浓度而降低产物的形成速度。另一方面，在机制,II,中，,ES,是至关重要的符合物，经过一个单分子过程（,1.1.4,式），,ES,复合物形成,产物。,下面要推导出能同时满足上述两种机制的速度方程。当考虑,EP,复,合物的形成时，酶以三种形式存在：,E,ES,和,EP,。,因此，酶的总浓度为,e,0,=E,0,=E+ES+EP (1.1.6),假定在酶反应中，下述平衡迅速建立起来,应用质量作用定律，有,(1.1.7),(1.1.8),其中，,m,和,n,为平衡常数，,x,为底物在时间,t,时的浓度，那么，,S=a-x,，,这里,a,为底物起始浓度。,P=x,这是两个可以测量的量。,式,1.1.6,1.1.7,和,1.1.8,组成一个联立方程组，含有三个未知量。,E,和,ES,的表达式为，,(1.1.9),(1.1.10),利用,1.1.9,和,1.1.10,式，产物,P,生成的速度方程可以推倒如下，,对于机制,I,P,通过一个双分子过程形成，产物的生成速度为,(,下面式子应为,k,+1,),对于机制,II,，,产物以单分子过程形成,(1.1.4,式,),，产物的生成速度,为：,(1.1.11),和,(1.1.12),式仅差一个常数。,为简化起见，只考虑反应的初相，可忽略产物的形成，因而,P=x,可以略去。,在,t=0,时，初始速度为,，,初始底物浓度为,s,0,，,ES,解离常数为,K,s,=1/m,(1.1.11),(1.1.12),那么，我们可以把,(1.1.11),和,(1.1.12),式简化成如下形式，,其中，,k,0,为比例常数，具有,sec,-1,因次。,对机制,I,：,k,0,=K,s,为,E,和,S,间双分子反应速度常数；,K,s,为,ES,复合物解离常数。,值得注意的是,Henri,机制,II,（,1.1.3,和,1.1.4,式）和速度方程,1.1.13,式与著名,的,Michaelis-Menden,机制和米氏方程相同。,Henri,是第一个得到为人熟,知的速度方程的人。,Henri,工作的特点：由不同的反应机制出发得到了形式相同的速度,方程。换句话说，机制,I,和机制,II,不能用这里讨论的动力学方法加以区,别，因为我们无法估计速度方程中经过推导而演绎出的常数。这说明了,动力学方法的固有的限制，尽管两种机制可以借助于不同的动力学技术,加以区别。,(1.1.13),二,.,Michaelis,and,Menten,的工作,1913,年,Michaelis,and,Menten,重新做了蔗糖反应转化酶催化的蔗,糖水解反应的实验。他们改进了实验条件，克服了,Henri,实验的缺点，采,取了如下的措施：,1.,控制水溶液的,pH,，,使用了,pH4.5,的醋酸,buffer;,2.,考虑了产物的变旋影响，使用,NaOH,终止反应，加速产物的变旋作,用。,典型的实验曲线如,Fig.1.1.1,所示，,Fig.1.1.1,蔗糖反应转化酶催化的蔗,糖水解反应的时间过程,最大底物浓度为,0.333M;,最小底物浓度为,0.0052M;,曲线,1,2,3,.,代表不同的底物浓度；,:,产物完成变旋后反应混合物旋光度,的变化。产物：,Glucose and fructose.,。,Henri,在他的实验中测量的是反应速度常数，而,Michaelis,and,Meten,建议利用反应初速度作为反应速度的一种测量。测量反应初速度的优点,在于可以消除产物可能产生的抑制作用以及在反应进行期间酶的钝化。,基于与,Henri,机制,II,相同的图示，,（,1.1.14),M-,Menten,利用与,Henri,使用的基本相同的方法得到了一个速度方程。推,导如下：,假定,E,和,S,的结合是处于快速平衡，即,则,ES,的解离常数,（,1.1.15),由,物种守恒，有,e,0,E,0,=E+ES,（,1.1.16),因只考虑反应初速度，固,EP,项可漏掉，,反应速度（初速度）为,=k,+2,ES,（,1.1.17),由,1.1.15-1.1.17,式，有,（,1.1.18),其中,V=k,+2,e,0,为最大反应速度。与,Henri,机制,II,比较，,k,0,=k,+2,则,（,1.1.18),式与,(1.1.13),式相同。,1.1.18,式就是,Henri,Michaelis,和,menten,推导,出的第一个讨论酶反应的速度方程。,快速平衡法的基本假定是下述平衡,迅速地建立起来，以致于,ES E+P,并不影响这一平衡。而由,ES,到,产物生成这一步是反应的限速步骤。解离常数,K,s,的,倒数可以作为酶对底,物的一种测量。,然而，应该指出，快速平衡法的基本假定有时不能成立，因为有的,反应,E+S ES,是不成立的。后来，稳台法对这一点做了改进。,三,.Brigg,和,Haldane,的工作,在,H-M-M,法中，假定,中的,k,-1,k,+2,，,这是一种特殊的限制。,1925,年,Brigg,和,Haldane,对,-M-,M,法做了改进，他们在推导速度方程时把,k,-1,k,+2,这一,假定取消了。他们,的方法就是现在大家熟知的稳态法或称为稳态近似。,在酶反应的过程中，中间产物,ES,一直稳定存在。,ES,的浓度变化可,用下式表示,dES/dt,=k,+1,ES (k,-1,+k,+2,)ES (1.1.19),在反应刚开始时，我们可以近似地认为反应速度,=k,+2,ES,是不变的，,因为,ES,也不变。换句话说，,dES/dt,与反应的总速度比较起来可以忽,略不计。,故有,dES/dt,=0,则,1.1.19,式,变成,k,+1,ES (k,-1,+k,+2,)ES=0,（,1.1.20),这个式子代替了迅速平衡法中的,1.1.15,式,(K,s,=ES/ES),。,利用物种守恒,e,0,=E,0,=E+ES,（,1.1.21),由（,1.1.20),和（,1.1.21),式得到,ES,复合物表达式,（,1.1.22),将（,1.1.22),代入速度方程,=k,+2,ES,则,（,1.1.23),在该法中,唯一的假定是,dES/dt,=0,取消了快速平衡法中的两个假定,这意味着稳态法较快速平衡法优越。容易看出（,1.1.18),式为,（,1.1.23),式,的特例，即当,k,-1,k,+2,时，,（,1.1.23),式,变成了（,1.1.18),式。,第二节 酶反应动力学方法,一,.,速度参数,(Rate parameters),由,H-M-M,酶反应机制,导出的速度方程有下面的形式,快速平衡,限速,步骤,(1.2.1),其中,和,是常数。,这个方程预示着：,1.,在底物浓度不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比；,2.,在底物浓度低时，,s ,，,反应速度达到一常量,e,0,。,反应速度与酶浓度的关系，以及与底物浓度的关系如,1.2.1,和,1.2.2,所示，,Fig.1.2.1,反应初速度与酶的,总浓度的关系,Fig.1.2.2,反应初速度与底物浓度,关系,如果定义两个变量,x,和,y,，,x=+s,y=e,0,（,1.2.2),那么，,(1.2.1),式可以变成如下形式，,xy,=e,0,这是矩形双曲线，极值为,V=,e,0,与,e,0,呈,正比。,常数,为当,=V,时，所对应的底物浓度，成为,Michaelis,常数，,用,K,m,值表示。,=V/e,0,表示单位时间内一个酶分子可以转化的底物分,子数，称为分子活力（,Molecular activity),用,k,0,表示。,对于寡聚酶来说，常使用催化中心活力的术语，即单位时间内酶分,子中每个催化中心所能转化的底物分子数，用,k,cat,（,Catalytic center,Activity),表示。,K,cat,=k,0,/n,。,有时，把分子活力或催化中心活力叫转化,数（,turnover number),。,这些在实验上可以测得的参数是进行动力学分析的基本常数，通常成,为速度参数或动力学常数，包括,K,m,k,0,(or,k,cat,),。,现在，我们用,K,m,V,k,0,(or,k,cat,),代替速度方程,中的,和，,那么速度方程有如下形式,（,1.2.3),对大多数酶反应来说，速度方程有如,（,1.2.3),式的形式，但也有例外，,变构酶，反应速度对底物浓度关系为,s,型曲线，而非双曲线。,应该指出，在实验中测得的速度参数或动力学常数是表观的，它们,的真实物理意义并不清楚。仅当我们把经验的速 度方程（,empirical,Rate equation),与由假定的机制推导的力学方程（,mechanistic rate,Equation),相比较时，这些参数如,K,m,和,k,0,（,empirical constants),，,它们,的物理意义才清楚：,empirical rate equation,（,1.1.18),由快速平衡法推导的方程,（,1.2.3),k,0,=k,=2,是,ES,复合物分解成产物的速度常数；,K,m,=K,s,是,ES,复合物解,l,离,常数。,比较（,1.1.18),和（,1.1.23),两式，,empirical rate equation,（,1.1.18),由稳态法推导的方程,（,1.1.23),则 有所不同，不在是,ES,的解离常数。,因此，速度参数的物理意义不仅取决于反应机制，也取决于推导,速度方程的方法。换句话说，要说明速度参数的物理意义，必须知道,反应机制；反过来，速度参数也可以对了解反应机制提供某些线索。,例如，当我们把,K,m,解释成,ES,的解离常数（,K,s,),时，并把,k,0,看成,ES,分解为产物的速度常数,k,+2,，,那么暗示，反应符合,H-M-M,机制，,而且，,k,+2,k,-1,。,二,.,速度参数的测定,通过重排（,1.1.18),式,可以得到三种不同形式的速度方程，由实验数据可以求出,K,m,和,V,max,。,其中，涉及三种作图法，即,1.,Lineweaver,-Burk,作图法（或双倒数作图法）；,2.,Woolf,或,Hofstee,作图法,;,3.,Eadie,作图法。,利用这些作图法可以检验实验数据与理论曲线（,=Vs/(K,m,+s),的情况,（见,Fig.1.2.1),。,Fig.1.2.1,三种作图法实验,数据与理论曲线拟合情况,Lineweaver,-Burk,作图法,;,(b),Woolf,或,Hofstee,作图法,;,(c),Eadie,作图法。,各种作图法有各自的优缺点。不过，从统计学观点（点的分布）来看,S/,对,s,图是,三种作图法中最好的一种，但 人们已习惯用双倒数,作图法。,三,.,进行酶反应动力学研究的基本程序和步骤,在文献中，已经发表了不少从各类酶反应机制推导出的速度方程，,但不少人可能不太熟悉推导这些方程的基本程序和步骤。,1.,推导速度方程的基本程序,首先，写出代表一个反应的机制的示意图,如,然后，由示意图出发推导速度方程。速度方程应包括物质浓度（,如,e,0,和,s,）,和速度常数。在速度方程中，反应速度是对其产生影响的物,质浓度和速度常数的函数。,e,0,和,s,是,实验中可测量的量。通常，在速度,方程中，不包括游离酶的浓度，因其在实验中不易测得到。,2.,影响酶反应速度的物质,（,1,）,催化剂（酶），反应后复原；,（,2,）底物和产物，经历化学变化；,（,3,）效应剂，能与酶分子按计量结合，而又不发生任何化学变化,来影响反应速度。,3.,在文章中如何讨论酶反应机制,如果所提出的一种酶反应机制不能解释实验结果的话，那么可以说,所提出的反应机制是不正确的。另一方面，应该注意，即使由某一机制,推导的速度方程与实验上得到的数据相符，也不能肯定地说这一机制是,正确的。例如,Henri,机制,I,尽管由它推导的速度方程在形式上与由,Henri,机制,II,推导出的一样，也不能说,Henri,机制,I,是正确的。除非我们能够证,明没有任何其他机制可以解释实验数据，否则我们还是不能说，这个机,制就是正确的。在处理动力学文章中，常常看到如下说法“结果与机制相,符”，“结果与机制相符”，“结果可以根据这一机制来解释。”“解释,实验结果的最小可能机制是”等。,如上所说，解释某一反应机制的酶动力学的基本方法之一是研究底,物，酶和效应剂浓度对反应速度的影响。因此，浓度因子是影响酶反应,速度的因素之一。研究浓度的影响可以使我们,check,由假定的反应机制导,出的速度方程的可靠性，可以使我们,examine,假定的反应机制是否可以,解释由实验中测得的浓度对反应速度的影响，也可以使我们,evaluate,速,度参数。进一步由假定的机制赋予速度参数某种物理意义。考察抑制剂,或激活剂的浓度影响，可以确定它们的抑制或活化机制，计算酶,-,效应剂,复合物的解离常数。一般来说，人们也把抑制常数（,k,i,),或活化常数（,k,a,),也称为速度参数。,4.,影响速度参数的因素,一般来说，速度参数（表观的）是指反应机制示意图中涉及的基本过,程速度常数的结合。因此，由浓度因素的研究得到的速度参数受下面两,个因素的影响：,（,1,）外部的或环境的因素：温度、压力、介质的物理性质，如溶剂,的介电常数、离子强度和黏度等。,（,2,）内部结构因子：,a.,底物与效应剂的分子结构；,b.,酶分子结,构，包括化学结构、构象（受温度、压力、,pH,和变性剂的影响），和,物理状态（如，固定化）。,概括起来说，影响酶反应速度的因素有三类：,浓度因素；,外部因素（环境因素）；,内部因素（结构因素）。,5.,进行动力学研究的基本程序,下面的框图归纳了进行酶动力学研究的基本程序：,Fig.1.2.2,进行酶反应动力学研究的基本程序示意图,第三节,酶反应的稳态动力学和瞬变动力学,一,.,酶反应的瞬变相,符合,Henri-,Michaelis-Menten,机制的酶反应是最简单,的酶反应，可以用,1.3.1,式来表示，,(1.3.1),这是一个单底物，不可逆反应。,根据酶反应的稳态动力学近似，在酶反应过程中，中间产物,ES,复,合物一直稳定存在。,ES,的浓度变化速率可以用,1.3.2,式表示，,其中,=ES,，,e=E,，,s=S,。,在酶反应的稳态阶段，,dx/dt,=0,。,dx/dt,=k,+1,e,s,(k,-1,+k,+2,)(1.3.2),我们现在感兴趣的是在,E,和,S,混合后，达到稳态前的过程。为此必须,解出微分方程,1.3.2,式，以便讨论,ES,复合物形成与分解的时间过程。,酶与底物物种守衡要求,e,0,=e+,（,1.3.3,）,s,0,=s+p,(1.3.4),产物的时间过程可以用下面的微分方程表示，,dp/dt,=k,+2,（,1.3.5,）,由,1.3.2,式,1.3.3-1.3.5,式原则上至少可以得到表示,e,，,，,s,和,p,的时间过程表达式。,作为一种,定性的,讨论，我们做如下处理：,当底物浓度比酶浓度大过量时，即,e,0,e,0,),，,至少在反应刚开始时，,p 1/k,(,因为,e,-kt,e,0,条件不成立，那么情况如何呢？,Chance,研究了过氧化,物酶的预稳态动力学。在,e,0,和,S,0,浓度数量级相同时，微分方程,1.3.13,和,1.3.14,dx/dt,=k,+1,e s (k,1 _+,k,+2,)x (1.3.13),dp/dt,=k,+2,x (1.3.14),不能解析解出。这些方程的模拟解,(analog),或数字解给出,EX=x,和,p=p,的时间过程。,Fig.1.3.4,过氧化物酶催化的反应曲线,(Stopped-flow),ES/,uM,P/,uM,很明显，由,Fig.1.3.4,看不到反映,ES,形成的平台。换句话说，,ES,稳,态不再明显出现。这种状态被称为,非稳态,。预稳态和非稳态通常称为酶,反应的,瞬变相,。,四,.,瞬变相出现的时间范围,由 式,=(a/k)(1-,e,-kt,),可以估计预稳态出现的时间。假如,ES,达,到它终值的,90%,，那么所需的时间,t,0.9,可以由下面的推导而获得。当,t=t,0.9,时,有,=0.9(a/k)=a/k(1-,e,-kt,),整理上式，把,t,写成有,t,0.9,，,则有,t,0.9,=ln10/k,=2.303/k,=2.303/k,+1,s,0,+(k,-1,+k,+2,),2.303/k,+2,=2.303/k,0,1 sec,k,0,为分子活力,在,10,0,到,10,7,sec,-1,之间，因而,t,0.9,在秒到微秒之间。这说明,如此快的反应需要特殊技术来测量。酶反应瞬变相的观察要求很高的探,测灵敏度和适当的酶浓度以及快速反应测量技术。在稳态动力学中使用,的酶浓度范围为,10,-5,-10,-10,mol/L,，,但这个浓度对瞬变动力学来说太低了，,通常要求,10,-4,-10,-6,mol/L,。,五,.,酶稳态动力学的限制,酶稳态动力学比较适合研究多底物酶反应，在这方面,Cleland,早在,1963,年就总结了基于浓度因子的动力学方法。对于双底物双产物的可逆,反应已经提出四种反应机制：有序双双，,Theorell,-Chance,，,无序双双和,乒乓机制。由于四种机制给出四种形式不同的速度方程，因此从动力学,上可以区别。表,1.3.1,列出了由上述四种机制推导的速度方程中分母的函,数形式。,表,1.3.1,双双机制速度方程分母的函数形式,尽管稳态动力学对于区别多底物酶反应是有用的工具，使我们知道哪种,底物先结合到酶分子上，哪种产物先从酶分子上解离下来。然而，对稳态,动力学来说有一个明显的限制。例如，在有序双双机制中，,括弧里的过程,表示在酶的活性部位，底物分子被转化成产物。从化学意义上说，这很,重要。,Cleland,把这种过程叫作中心复合物“异构化”过程。稳态动力学无,法把下面的多步机制,与一步机制,无法区别开。它只能处理由这些反应机制出发得到的总的速度方程。,显然，直接研究总反应的基本阶段可以消除这种限制。瞬变动力学的,基本目标就是观察发生在酶分子上的变化，弄清反应的基本步骤。这是,瞬变动力学的重要性所在。测定溶液中,快速反应的技术对瞬变动力学来说是重要的，因为总反应中的基本阶段通常仅发生在几秒钟内。利用停,流或温度跳跃（,Temperature jump,）,装置可以测量如此快的反应。,