毛细管凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,毛细管凝胶电泳,(,capillary gel electrophoresis,),讲解人：操兰,学号：,2015110239,Contents,1,发展简史,2,毛细管凝胶电泳的原理,3,毛细管凝胶柱的制备技术,4,现有交联,凝胶,柱制备技术,5,凝胶缺陷的形成原因和避免措施,6,毛细管凝胶电泳的应用,7 CGE,技术的问题与展望,8,相关文献,一、发展简介,1.,早在六十年代,Hjerten,就尝试过毛细管电泳技术,在七十年代,Virtanen,和,Mikkers,等人 也进行过研究。由于受到检测器灵敏度的限制,不能用细内径的毛细管,电泳过程中产生的焦耳热不能很好地散失,以致限制了高电压的运用,严重影响了分离效率。,2.,七十年代末,毛细管技术的广泛应用,使得人们加快了对细管电泳的研究。,1951,年,Jorgensen,等人改善了检测器的灵敏度,可以使用,75u,m 内径的玻璃毛细管,并采用了3,0,kV的高压,获得了很高的效率(N,=,4x10,5,s)。他们对毛细管电泳分离理论的研究以 及柱效方程的推导,对毛细管电泳技术的发展起了巨大的推动作用。,3.1983,年,hierten,首次将传统凝胶电泳技术中的聚丙烯酞凝胶装入15,0u,m 的玻璃毛细管,以消除毛细管内壁对蛋白质的吸附,并利用这种方法对多种蛋白质进行了分离,取得了很好的分离效果。,1957,年,oChen,和,Karger,使用了100,u,m 内径以下的弹性石英毛细管,用同管内壁交联的方法制备凝胶柱,分离了蛋白质、,DNA,和寡聚核昔酸。,4.1990,年,Lux,和,Yin,等人对,oChen,和,Karger,柱制备技术进行了改进,提出了用线性聚丙烯酞胺对柱内表面预处理和用射线引发聚合的方法,在分离,DNA,内切片段和寡聚核昔酸时取得极好的效率。,二、基本原理,毛细管凝胶电泳(CGE)是毛细管电泳的几种操作模式之一,特别适于分离蛋白质、核酸片段等生物大分子,具有分离能力强、速度快等特点。,毛细管凝胶电泳,是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用,溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大,能减少溶质的扩散,所得峰形尖锐,能达到最高的柱效。常用聚丙烯酞胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离测定蛋白质和的分子量或碱基数,但其制备麻烦,使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酞胺,可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质，它能避免空泡形成,比凝胶柱制备简单,寿命长,但分离能力比凝胶柱略差。,22,毛细管凝胶电泳,用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的体积大小和组分的质荷比来进行分离,大分子出来的快，小分子出来的慢。,聚丙烯酰胺凝胶（,PAG,）：以丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺作为交联剂，由过硫酸铵与四甲基乙二胺为氧化还原反应产生的自由基催化聚合而成。,PAG,的孔径一般在,3,30nm,左右，适合分离核酸片段结构。,琼脂糖凝胶（,AG,）：由琼脂糖在氢键作用下结合而成，孔径大，常用来分离蛋白质分子和大的,DNA,片段。,凝胶的种类,CH,2,=CH,CO,NH,2,CH,2,=CH,C=O,NH,CH,2,NH,CH,2,=CH,C=O,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的,优点,：,1.,电泳峰,尖锐，柱效极高,2.,短柱上实现极好的分离,3.,试样容量为10,12,g,主要缺点:制备柱较困难，寿命较短。,已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、,DNA,等强有力的工具。例应用,CGE,分离与激光诱导荧光检测相结合，用于,DNA,序列快速分析。,22,2 分离模,毛细管凝胶电泳,三、毛细管凝胶柱制备技术,毛细管凝胶柱的性能指标,(1)柱稳定性(即柱寿命),这是评价毛细管凝胶柱的一个重要指标,各种柱制备方法都力求提高柱稳定性,没有高的稳定性,就没有迁移时间和峰面积的高度重现性;,(2)柱分离效率;,(3)迁移时间的重现性(在DNA 序列分析中尤其重要)。,在毛细管中制备聚丙烯酰胺凝胶通常包括以下几步操作:,(1)毛细管内壁的处理,a)用有机溶剂、碱液、水清洗毛细管内壁;,b)在毛细管内壁键合双官能团试剂(如MAPS);,c)使双官能团试剂与单体聚合形成一层聚合物薄膜。,根据需要,有时可以省去操作 c 或者操作 b和 c。,(2)预聚溶液的准备(包括过滤、脱气、引发剂的加入);,(3)将预聚溶液导入毛细管;,(4)使预聚溶液在毛细管中聚合,;,四、现有的交联凝胶柱制备技术,(1)Y.Baba 法毛细管只用上节中操作(1)a 进行预处理,催化剂和引发剂浓度较低,柱中凝胶预聚溶液在比较温和的条件下聚合,此法制得的柱子稳定性较差,但在较低的场强下可以使用 50 多次,而且制备方法简单,成功率较高,可以弥补稳定性方面的不足。,(2)B.L.Karger 法毛细管依次用操作(1)a,b 进行处理,当凝胶预聚溶液在管内聚合时,内表面上的双官能团试剂与凝胶聚合在一起。这一类凝胶柱的稳定性很高,报导过使用的最高记录达 200 多次,并能忍受较高的场强。但是先键合在管壁上的双官能团试剂的烯烃双键参与了凝胶形成,使得聚合过程中溶液流动性变差,不利于未反应溶液去填补体积收缩;另一方面,内表面处理过的毛细管疏水性增加,润湿性下降,在充入预聚溶液时,本体溶液与管壁间可能存在极薄的间隙。这两种因素都增加了聚合过程中形成凝胶缺陷的机会。,(3)HP(惠普公司)专利方法这一方法的特点是对正在聚合的凝胶溶液施加高压,使其体积收缩,收缩的程度与其聚合后体积收缩的程度相匹配。这种方法使用的压力最少需要 120 个大气压,而且凝胶 T 值越大,所要求的压力也越高。,(4)H.F.Yin(尹红峰)法毛细管依次用操作(1)a,b,c 进行处理,使管内壁覆盖一层线性聚合物涂层,增加了管内壁的浸润性,双官能团试剂不再参与聚合反应,配合使用高压,减少了凝胶缺陷的产生,同时也极大地减小了电渗流,柱稳定性相对提高。用这种方法制备的柱子,分离能力很强,对 400 多碱基数的核苷酸片段达到单碱基差异分离。但这一方法并没有得到广泛应用,可能是步骤较多,重复性较差。,(5)J.A.Lux 法这一方法的特点是以,C,射线引发聚合反应,避免 APS2TEMED引发剂体系产生的荷电副产物对凝胶结构的损害,反应可以控制在较温和的条件下进行,而且一次可以制备多根毛细管凝胶柱,但推广起来受辐射源的限制。,(6)T.Wang 法这一方法采用核黄素2TEMED 体系作引发剂,在紫外光的照射下进行游离基聚合反应,毛细管置于冰水浴中,聚合以较温和的方式进行,据报导,成功率在80%以上,而且可以避免APS2TEMED 引发体系残存氮氧化物对分离对象的氧化作用;但使用的毛细管外涂层必须能透过紫外光。,(7)V.Dolnik 法 这一方法采用渐次聚合的思想,即控制聚合反应从毛细管一端开始,并逐步延伸到另一端,这样聚合部分的体积收缩就有可能被前方未聚合的粘度较小的单体溶液不断补充,从而减少了凝胶缺陷的形成。他们尝试了4 种控制方式,即温度程序、渐次光聚合、激光引发光聚合和等速电泳法,最后认为等速电泳法最为简便可靠。用此法可以制备浓度较高的凝胶(T=30%),这是前几种方法难以达到的。,(8)陈义法 这一方法的基本思路是加压温度梯度聚合,让充满凝胶预聚溶液的毛细管下端浸在 40的水中,垂直的上端在冰水中,从上端加 7 8 个大气压,25室温下,毛细管垂直悬挂;另一个操作是对毛细管两端用双官能团试剂,MAPS,进行处理,提高了柱稳定性。用这种方法制备低浓度的柱子,成功率 100%,高浓度柱子(T=15%30%)成功率也在 90%以上,稳定性很高,使用时间可达 70h 以上。这一方法是目前制柱技术中水平较高的一种。,五、凝胶缺陷的形成原因和避免措施,传统的凝胶电泳中,凝胶多制成薄层,这比较容易,但是要在内径几十微米的毛细管中制成连续、稳定、分离能力强的凝胶并不容易。,由于凝胶在聚合过程中体积收缩,如果不断缩小的体积不能及时得到补充,毛细管中将出现凝胶缺陷(亦称为 bubble 或 void)。,在无凝胶缺陷的凝胶柱使用过程中,也可能出现凝胶缺陷并随着使用时间而增大或增多。,(1)电渗流效应,在负极端口电渗流对凝胶的推动力缺少凝胶与管壁间摩擦力的抗衡,而管外的缓冲溶液对端口内凝胶的静压力又远远不足以抗衡电渗推动力,以致无法阻挡凝胶自负极端被推出。,(2)离子贫化效应,同一种离子,在凝胶中与在管外缓冲溶液中的迁移数(即离子所运载的相对电荷数)不同。电泳过程中,离子通过凝胶与管外缓冲溶液界面处时,将在此界面上引起离子浓度差异,在常用的 PAG 分离体系中其结果是在毛细管内的负极端出现离子贫化区,这一段的电阻增高,场强加大,电渗流效应增强。,(3)样品效应,大样品分子在经过较小的凝胶网孔时,会在进样的负极端堆积,在局部区域内形成高电阻区,场强增大,从而使电渗流效应加强;另外,残留的大分子在电场作用下对凝胶网络施加更大的压力,网络伸张引起的瞬时拉力对网络产生破坏作用。,六、毛细管凝胶电泳的应用,凝胶的抗对流和分子筛作用的特点对分离大分子物质最有利,。,毛细管凝胶电泳最主要的应,用,方面是蛋白、多肤、寡聚核昔酸和DNA,。,1,定量分析蛋白质和多肽,2,研究寡聚糖核苷酸,3 DNA,内切片的分离,我们在制备或使用毛细管凝胶柱时应当注意采取以下措施:,(1)对毛细管内壁进行涂层处理,尽量减小电渗流;,(2)尽量避免使用会引起凝胶材料水解的缓冲溶液;,(3)避免使用过高的场强,在对凝胶柱施加或切断电压时,要以较缓和的梯度方式进行;,(4)保存和使用凝胶柱时都应当尽可能地避免柱温的急剧变化;,(5)尽可能地了解分离对象的尺寸大小,据此选择孔径大小适当的凝胶体系;,(6)在缓冲溶液瓶中加入较稀的与凝胶体系相同的高分子单体溶液,以减小离子贫化效应。,七、,CGE,技术的问题与展望,（,1,）凝胶在制备过程中因剧烈的聚合反应或者在使用过程中的高电压(,350,V,/,cm),下而产生一些气泡。气泡中断了电路,使柱子报废;另外,一些大的DNA 分子的,积留,也会严重影响柱寿命。,（,2,）孔径大小的控制一般通过凝胶浓度来实现,但通过测定孔径大小的范围对柱参数进行评价的方法仍未解决。,（,3,）分析重现性有待改善,这依赖于对分离条件(如电源、散热、添加剂、缓冲体系及其pH值等)的研究和控制以及柱性能的改善。,（,4,）检测器尤其是激光诱导荧光检测器技术还没有成熟。,八、相关文献,毛细管凝胶电泳法测定硫代寡核苷酸药物癌泰得的含量,杨秉呼，孙偶君，张敏丽，王升启,（军事医学科学院放射医学研究所，北京）,癌泰得为,20,碱基的抑制端粒酶催化亚基,hTERT,的硫代反义寡核苷酸,体内、体外抗肿瘤活性评价显示其有较好的抗肿瘤活性。采用固相合成仪分别制备了癌泰得及与其碱基百分组成基本相同的硫代寡核苷酸内标，并使用制备型阴离子交换色谱和反相高效液相色谱进行纯化。毛细管凝胶电泳用于分析硫代寡核苷酸，可分离长度相差一个核苷酸的序列，因此使用,CGE,不仅可确定寡核苷酸的含量，而且可确定其代谢产物的组成和长短具有其他分析法无法比拟的优点。采用毛细管凝胶电泳仪和单链分离试剂盒测定了癌泰得的含量。,结论,毛细管凝胶电泳法用于硫代寡核苷酸药物癌泰得的定量分析，具有灵敏、线性范围宽、精密度高、回收率好等优点，而该法本身又具有样品用量极少、可分离相差一个碱基寡核苷酸的优点，因此为其药代动力学及毒代动力学等研究奠定了基础。,部分交联聚丙烯酰胺用于毛细管凝胶电泳蛋白质分离,周瑾,徐建栋,谢瑶,屈锋,邓玉林,耿利娜*北京理工大学生命科学与技术学院,北京 100081*联系人,E-mail:lngeng,以高分辨低黏度可替换的部分交联聚丙烯酰胺作为毛细管凝胶电泳的分离筛分介质,实现了溶菌酶、细胞色素 C、核糖核酸酶 A 和胰蛋白酶 4 种碱性蛋白的基线分离.该聚合物材料具有的动态涂渍能力减少了毛细管壁对蛋白质的吸附,显著改善了分离重现性.混合使用两种部分交联聚合物,分离分辨率和塔板数获得进一步提高.,目前毛细管凝胶电泳(CGE)绝大多数局限于蛋白质分子量的测定,测定过程中蛋白质需被变性处理,很少有应用 CGE 分离分析活性蛋白质的报道,然而只有实现活性蛋白质的分离才能更好地为生物相关研究提供服务,比如在继承传统凝胶电泳优势的基础上,开发出高通量、高分辨率和快速的微通道电泳分离分析新技术和新方法,满足蛋白质组学所提出的更高要求.因此,在参考文献的基础上,本文报道使用一种或两种混合的部分交联聚丙烯酰胺凝胶(semi-CPAs)进行非变性蛋白质的CGE 分离,不仅实现了碱性蛋白质的基线分离,同时发现这种材料具有良好的动态涂覆毛细管内壁的能力.,分析认为,这种新型部分交联聚丙烯酰胺凝胶是介于交联凝胶和非交联线性可替换凝胶筛分介质之间的一个状态.,针对不同分离对象，我们不仅可以通过优化单体和交联剂浓度,而且还可以通过混合不同的 semi-CPAs 建立适宜的筛分网络结构,实现对分离能力的灵活选择性调整。,结论,在温和条件下,而不是极酸极碱或有变性剂的条件下实现碱性蛋白质分子的分离是毛细管电泳技术的一个难题.本文所使用的部分交联聚丙烯酰胺凝胶实现了溶菌酶、细胞色谱 C、核糖核酸酶 A 和胰蛋白酶 4 种碱性蛋白的基线分离,并且重现性良好.通过混配凝胶还可进一步提高分离度和分离柱效.因此初步研究表明,部分交联聚丙烯酰胺凝胶同时具有高分辨的筛分分离能力、良好的管壁动态涂层和黏度低等优点,有望在毛细管电泳以及微流控芯片电泳中得到应用,进而推动微通道凝胶电泳在蛋白质组学等领域中发挥更大作用.,The End,Thank You,！,