第六章_蛋白质的测定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述,1.,蛋白质概况,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由,C,、,H,、,O,、,N,、,S,五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的,P,、,Cu,、,Fe,、,I,等。,蛋白质是生命的物质基础，人体,11%-13%,总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味及其营养。,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。,例如牛肉中蛋白质含量为,20.0%,左右，猪肉,9.5%,，兔肉,21%,，鸡肉,20%,，牛乳,3.5%,，带鱼,18.0%,，大豆,40%,，面粉,9.9%,，菠菜,2.4%,，黄瓜,1.0%,，苹果,1.4%,测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。,一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；,凯氏定氮法、双缩脲反应、福林,-,酚试剂法、染料结合反应。,一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,紫外测定、酸碱滴定法。,蛋白质的测定方法分两大类,第二节 蛋白质的定量测定,一、凯氏定氮法,由,Kieldhl,于,1833,年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。,=N6.25=,蛋白质含量,乳制品,K=6.38,（,N=15.7%,）小麦粉,K=5.79,（,N=17.6%,）,动物胶,K=5.6,（,N=18.0%,）冰蛋,K=6.7,（,N=14.8%,）,大豆制品,K=6.0,（,N=16.7%,）,在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，如,核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素,，所以只能称为,粗蛋白的含量,。,国际标准,ISO 18711975,农产食品,凯氏法测定氮含量的一般性说明,含非蛋白质氮多的食品要单独测,GB/T 21704-2008,乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定,1,、原理,整个过程分三步：消化,蒸馏和吸收,滴定,样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。,用,H,3,BO,3,吸收后,再以标准,HCl,溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。,（,1,）消化总反应式,2NH,2,(CH,2,),2,COOH+13H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,+6CO,2,+12SO,2,+16H,2,O,一定要用浓硫酸（,98%,）,原理,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，,Gunning,将消化方法改进，在消化时加入,K,2,SO,4,使沸点上升，这样加快分解速度，温度由原来硫酸沸点的,330,上升到,400,，提高了,67,，所以速度也就加快了。,随着消化反应过程，水份逸出，硫酸钾浓度增大，使沸点增加。,加速了有机的分解。,也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。,但是硫酸钾浓度不可以太高，否则温度太高，生成的硫酸氢铵会分解放出氨，造成氨的损失。,K,2,SO,4,和,H,2,SO,4,的添加比例是：,1g,样品中,K,2,SO,4,:H,2,SO,4,=7g:12mL,加硫酸铜 作为催化剂，还可以做蒸馏时碱性指示剂。,CuSO,4,Cu,2,SO,4,+SO,2,+O,2,C+,CuSO,4,Cu,2,SO,4,+SO,2,+CO,2,H,2,SO,4,+Cu,2,SO,4,CuSO,4,+SO,2,+2H,2,O,氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。,加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。,受热,消化装置,（,2,）蒸馏 消化液,+40%,氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。,(NH,4,),2,SO,4,+NaOH,NH,3,+Na,2,SO,4,+H,2,O,原理,（,3,）吸收与滴定,用,2%,硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定,.,2NH,3,+4H,3,BO,3,(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,(NH,4,)2B,4,O,7,+2HCl+5H,2,O,2NH,4,Cl+4H,3,BO,4,指示剂用混合指示剂（甲基红,溴甲基酚绿混合指示剂）,指示剂,红色,绿色,红色,（酸）（碱）（酸）,甲基红,溴甲基酚绿混合指示剂：变色点,pH 5.1,酒红色,绿色,吸收,滴定,原理,2,实验步骤,（,1,）样品消化,称取适量样品,0.12g,（固体），移入干燥的消化管中，加入,0.2g,硫酸铜，,3g,硫酸钾及,20mL,硫酸，轻轻摇匀后进行消化。,先小火消化，待消化液呈蓝绿色澄清透明后，再继续大火加热,0.5h,，至溶液呈透明淡黄绿色为止。停火冷却后，将消化液用水定容至,100 mL,。,空白对照：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。,（,2,）碱化蒸馏,向接收瓶内加入,10mL2%,硼酸及,2,滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下。,吸取,10.0mL,样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用,10mL,蒸馏水冲洗进样入口，再加,10mL50%,氢氧化钠溶液，通入蒸汽开始蒸馏，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏,5min,，取下接收瓶。停止蒸馏。,（,3,）滴定,用微量酸式滴定管，以,0.05mol/L,盐酸标准溶液进行滴定，溶液由,蓝绿色,变为,灰红色,为终点。,（,4,）空白试验,同时取,10.0mL,空白消化稀释液同上操作。,实验步骤,（,5,）计算,总氮量,%=N(V2-V1)0.014/W 100,0.014-,氮的毫克当量数,蛋白质,%=,总氮,%K,K-,换称等数：,乳制品,K=6.38,（,N=15.7%,）,小麦粉,K=5.79,（,N=17.6%,）,动物胶,K=5.6,（,N=18.0%,）,冰蛋,K=6.7,（,N=14.8%,）,大豆制品,K=6.0,（,16.7%,）,K=6.25,（,N=16%,）,实验步骤,(1),所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。,(2),消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，勿使炭化物质上升到消化管上部。待消化液均匀沸腾后，再加大火力。,(3),消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。,3,注意事项,(4),如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失。而硫酸不与氨作用，因此当硫酸过多被底物消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。,(5),样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。,注意事项,(6),般消化至呈透明后，继续消化,30min,即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。,注意事项,北京福德泰和科技有限公司,产品名称：凯氏定氮仪,二、双缩脲法,传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。,新开发的：双缩脲法、,紫外分光光度法、,染料结合法、,水杨酸比色法,脲（尿素）,NH,2,CONH,2,加热至,150160,时，两分子缩和成双缩脲。,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成,紫色络和物,，这种反应叫双缩脲反应（缩二脲反应）。,NH,2,CONHCONH,2,+NH,3,NH,2,CONH,2,+,NH,2,CONH,2,1,原理,蛋白质分子中含有肽键,CONH,与双缩脲结构相似。,碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质,-,铜络合物，,溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（,560nm,）,碱性酒石酸钠：,10mL KOH(10mol/L),溶液和,20mL,酒石酸钾钠,(25%),加到,930mL,水中，激烈搅拌，同时加入,4%CuSO4,液,40mL,。,2,试剂,（,1,）标准曲线绘制,取蛋白质液,0.0 2.0 4.0 8.0 10.0mL,于,10mL,容量瓶,分别加水定容,10mL,加,50mL,碱性酒石酸钾钠,吸混合液,15mL,离心到完全透明,取上清液,5mL,于,10mL,容量瓶加水定容,560nm,处测定吸光度,以吸光值和蛋白质含量绘制标准曲线,（,2,）样品测定：,准确称样,0.5g,于,10mL,离心管,加,50mL,碱性酒石酸钾钠同上，,560nm,处测定吸光度，从标准曲线上查出蛋白质含量。,3,试验方法,双缩脲法对白、红蛋白产生的颜色反应相近，不受温度影响。可快速测定蛋白质含量，但灵敏度低，测定范围为,1,20mg,蛋,白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定，常用于谷物蛋白质含量测定。,三羟甲基氨,基甲烷、一些氨基酸和,EDTA,等对本反应有干扰。,方法特点及应用范围,三、,Folin-,酚法测定蛋白质含量,1.,原理：,Folin-,酚试剂法包括两步反应：,第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质,-,铜络合物；,第二步是此络合物将磷钼酸,-,磷钨酸试剂,(Folin-,酚试剂,),还原，产生深蓝色,(,磷钼蓝和磷钨蓝混合物,),，颜色深浅与蛋白质含量成正比。,因为,Folin-,酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物氨基酸（酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）,在,750nm,有最大吸收。,实验的优点：,Folin-,酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定。,Folin-,酚法的灵敏度比双缩脲法高,100,倍，肽键显色效果增强,，,减少了因蛋白质种类引起的偏差,。该法由于两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别高,，所以适于,20,250ug,微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量达,5 ug,。,2.,试剂,Folin-,酚试剂,试剂甲,：,（,A,）称取,10g Na,2,CO,3,，,2g NaOH,和,0.25g,酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至,500mL,。,（,B,）称取,0.5g CuSO,4,5H,2,O,，溶解后用蒸馏水定容至,100mL,。,每次使用前将（,A,）液,50,份与（,B,）液,1,份，即为试剂甲。,试剂乙：,在,1.5L,容积的磨口回流器中加入,100g,钨酸钠和,700mL,蒸馏水，,25g,钼酸钠，再加,50mL 85,磷酸和,100mL,浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流,10h,。,回流结束后，加入,150g,硫酸锂和,50mL,蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾,15min,，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。然后稀释至,1L,，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。,3.,试验方法,(1),标准曲线的制作,配制标准牛血清白蛋白溶液：,250g/mL,的牛血清白蛋白溶液，取,0,、,0.2,、,0.4,、,0.6,、,0.8,、,1.0mL,加水定容至,1.0mL,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。,然后各加,Folin-,酚试剂甲,5mL,，混合后在室温下放置,10min,，,再各加,0.5 mLFolin-,酚试剂乙，立即混合均匀，静止,30min,后。,以不含蛋白质的,1,号试管为对照，用分光光度计于,750nm,波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。以牛血清白蛋白含量（,g,）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。,(2),样品的提取及测定,准确称取样品,1g,，放入研钵中，加蒸馏水,2mL,，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用,6mL,蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管,.,离心,4 000r/min,、,20min,。,将上清液转入,50mL,容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。,(3),取普通试管,2,支，各加入待测溶液,1mL,，分别加入试剂甲,5mL,，混匀后放置,10min,，再各加试剂乙,0.5mL,，迅速混匀，室温放置,30min,，于,750nm,波长下测定光密度，并记录结果。,计算,从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量,X,（,g,），再计算样品中蛋白质的百分含量。,蛋白质含量（）,=X,（,g,）,稀释倍数,(,样品重,10,6,),试验注意事项,（,1,）,Folin,乙试剂仅在酸性,pH,条件下稳定，但此实验的反应只是在,pH10,的情况下发生，所以当加试剂乙时，必须立即混匀，以便在磷钼酸,-,磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。,（,2,）,Folin,试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，不同蛋白质含量不同而使显色强度稍有不同。本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。,3,）,酚类和柠檬酸、硫酸铵、,Tris,缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油,、还原剂,(,二硫代苏糖醇、巯基乙醇）,EDTA,和脲素均会干扰反应。但质量分数或体积分数在,5,时，尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮对显色无影响，高浓度时必须作校正曲线。,四紫外吸收法,1.,原理：,构成蛋白质的,20,种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区,(220nm),均有光吸收。在近紫外区(220-300,nm),只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力,，,最大吸收峰在,280nm,波长处。在此波长范围内，在蛋白质浓度,38mg/mL OD,280nm,光密度与其浓度呈正比关系，可作定量测定。,应用：,紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用,280nm,进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。,2.,试剂,（,1,）标准牛,血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为,1mg/mL,的溶液。,（,2,）待测蛋白质溶液：浓度为,1mg/mL,左右的溶液。,3.,实验方法,(1),标准曲线制作,选一种,与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品,，,分别向每支试管内加入,0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mL,溶液,，,加蒸馏水定容到,5.0mL,混匀。,以光程为,1cm,的石英比色杯，在,280nm,波长处测定各管溶液的光密度值,OD,280nm,。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。,(2),样品测定,取待测蛋白质溶液,1mL,，加入蒸馏水定容至,5mL,，混匀，按上述方法测定,280nm,的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。,1,、对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。,2,、温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在,2030,。,4.,实验注意,(3),实验中不饱和醛、酮、嘌呤、嘧啶和核苷酸都有紫外吸收，所以使结果偏高。其中尤以核酸,(,嘌呤和嘧啶碱,),的影响更为严重。,然而核酸的最大吸收峰是在,260nm,。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定,OD,260nm,与,OD,280nm,，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。,通常纯蛋,白质的,OD,280nm,/OD,260nm,约为,1.8,，而纯核酸的比值约为,0.5,。,利用经验公式直接计算样本蛋白质含量,a,、,OD,280,OD,260,1.5,时,，用,Lowry-Kalokar,公式：,样本蛋白质含量,(mg/mL),1.45 OD,280,一,0.74 OD,260,b.,根据,OD,280nm,/OD,260nm,从,校正因子表,查出校正因子,“,F,”,值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将,F,值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。,蛋白质浓度（,mg/mL,）,=F,OD,280nm,紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子,OD,280nm,/OD,260nm,校正因子,核酸,%,OD,280nm,/OD,260nm,校正因子,核酸,%,1.75,1.116,0.00,0.846,0.656,5.50,1.63,1.081,0.25,0.822,0.632,6.00,1.52,1.054,0.50,0.804,0.607,6.50,1.40,1.023,0.75,0.784,0.585,7.00,1.36,0.994,1.00,0.767,0.565,7.5,1.30,0.970,1.25,0.753,0.545,8.00,1.25,0.944,1.50,0.730,0.508,9.00,1.16,0.899,2.00,0.705,0.478,10.00,1.09,0.852,2.50,0.671,0.422,12.00,1.03,0.814,3.00,0.644,0.377,14.00,0.979,0.776,3.50,0.615,0.322,17.00,0.939,0.743,4.00,0.595,0.278,20.00,0.874,0.682,5.00,四,.,考马斯亮蓝,G-250,法,1.,原理,考马斯亮蓝,G-250,（,Coomassie brilliant blue G-250,）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。,考马斯亮蓝,G-250,在游离状态下呈,红色,，最大吸光吸收在,488 nm,；当它与蛋白质结合后变为,青色,，蛋白质,-,色素结合物在,595nm,波长下有最大光吸收。蛋白质与考马斯亮蓝,G-250,结合在,2min,左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下,1h,内保持稳定。,595nm,光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。,特点：,该法是,1976,年,Bradford,建立，试剂配制简单，操作简便快捷,.,考马斯亮蓝,G-250,法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法，最低蛋白质检测量可达,1ug,，比,Folin,一酚法约高,4,倍。测定蛋白质浓度范围为,0,1000g/mL,，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,2.,实验试剂,蛋白试剂考马斯亮蓝,G-250,的配制：称取,100mg,考马斯亮蓝,G-250,，溶于,50mL 90,乙醇中，加入,85,（,W/V,）的磷酸,100mL,，最后用蒸馏水定容到,1L,。此溶液在常温下可放置一个月。,3.,试验方法,(1),标准曲线制作,0100g/mL,标准曲线的制作：取,6,支,10mL,干净的具塞试管，取,0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mL,用蒸馏水定容至,1.0mL.,加考马斯亮蓝,G-250,试剂,5mL,盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合,.,比色：放置,2min,后,用,1cm,光经的比色杯在,595nm,波长下比色，记录各管测定的光密度,OD,595nm,，并做标准曲线,.,标准曲线制作,管 号,1,2,3,4,5,6,1 000g,mL,标准蛋白液（,mL,）,0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,蒸馏水（,mL,）,1.00,0.98,0.96,0.94,0.92,0.90,考马斯亮蓝,G-250,试剂（,mL,）,5,5,5,5,5,5,蛋白质含量（,g,）,0,20,40,60,80,100,OD,595nm,待测液蛋白质浓度测定,管 号,13,14,蛋白质待测样品提取液（,mL,）,0.1,0.1,蒸馏水（,mL,）,0.9,0.9,考马斯亮蓝,G-250,试剂（,mL,）,5,5,OD,595nm,蛋白质含量（,g,）,(2),样品蛋白质的测定,4.,实验注意,1,、该方法干扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。,仍有强碱性缓冲液、,TritonX-100,、十二烷基硫酸钠,(SDS),、去污剂等干扰该反应。考马斯亮蓝,G-250,与蛋白质的反应物易附着在比色杯内壁上。,2,、,蛋白质与考马斯亮蓝,G-250,结合的反应十分迅速，在,2min,左右反应达到平衡；其结合物在室温下,1h,内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。,3,、该法主要问题是线性关系较差，在蛋白质含量很高时线性偏低。,H,浓度是影响线性关系的主要因素。,4,、,不同来源蛋白质与考马斯亮蓝,G-250,结合状况有一定差异。,