《多聚酶链式反应扩增DNA片段》.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,多聚酶链式反应扩增,DNA,片断,一、基础知识,（一）,DNA,分子的结构,C,、,H,、,O,、,N,、,P,1,、组成元素,脱氧核苷酸,2,、基本单位,3,、脱氧核苷酸结构,脱氧核苷酸结构式,一个核苷酸上的,磷酸基团上的,“,OH,”,和,另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,磷酸二,脂键,，,即在,相邻的,两个脱氧核苷酸的,3,和,5,碳原子,之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,、,5,、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。,通常将,DNA,的,羟基,“,OH,”,末端称为,3,端，而磷酸基团的末端称为,5,端,4,、多脱氧核苷酸链的形成,O,O,P,O,HO,碱基,O,OH,O,O,P,O,HO,OH,碱基,5,3,3,5,碱基,脱氧核糖,磷酸基团,碱基,脱氧核糖,碱基,脱氧核糖,5,3,多脱氧核苷酸链结构简图,5,、,DNA,分子的空间结构（,双螺旋结构）,DNA,分子是由两条反向平行的（即一条链为,3,5,，另一条链为,5,3,）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构,脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧,两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基互补配对：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对,（二）,DNA,的复制,2,、时期,有丝分裂间期、减数第一次分裂前的间期,3,、场所,细胞核（主）,4,、模板,DNA,母链,1,、概念,由一个,DNA,形成两个完全相同的,DNA,的过程,5,、原料,脱氧核苷酸,6,、基本条件,酶、,ATP,、原料、模板,7,、复制过程,A、,解旋,B、,合成子链,C、,合成子代,DNA,DNA,聚合酶,1,、,DNA,聚合酶,特性,不能从头合成,DNA,，只能从,DNA,的,3,端开始延伸,DNA,链，因此，,DNA,复制需要引物,2,、,DNA,聚合酶,作用过程,当引物与,DNA,母链通过碱基互补配对结合后，,DNA,聚合酶就能从引物的,3,端开始延伸,DNA,链，,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端延伸,引物的合成,DNA,的生成,形成子代,DNA,分子,DNA,的解旋,9,、精确复制的原因,10,、复制的意义,DNA,分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性,规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行,8,、复制特点,边解旋边复制,(,过程）,半保留复制（结果）,（三）,PCR,(,多聚酶链式反应）,在,80,100,C,的温度范围内，,DNA,的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性,当温度缓慢降低后，两条彼此分离的,DNA,链又会重新结合成双链,PCR,利用了,DNA,的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合,1.,PCR,概念,2.,PCR,原理,3,、,PCR,的条件,比较,ATP,提供,高温变性解旋,解旋方式,解旋酶催化,能量,场所,活细胞 细胞核,耐热性低,四种脱氧核苷酸,引物酶,RNA,生物体外 加入稳定的缓冲液,耐热性高,Tap,DNA,聚合酶,需加入人工合成的引物,DNA,不需,ATP,提供,PCR,扩增,DNA,复制,DNA,聚合酶,原料,引物,设备,不需 常温进行,严格控制温度的温控设备,四种脱氧核苷酸,（四）,PCR,的反应过程,1,、,PCR,的反应步骤,PCR,一般经历三十多次循环，,每次循环可以分为三个基本步骤,变性、复性和延伸,变性（模板,DNA,解旋）,模板,DNA,经加热至,90,0,C,以上。一定时间后，使模板,DNA,双链在热作用下，氢键断裂，形成单链。,2,、循环过程,靶序列,靶序列,PCR,循环第一步：加热变性,复性（退火）,模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降到,50,0,C,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR,循环第二步：引物与靶序列退火,延伸,DNA,模板引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的,DNA,链,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,聚合酶,PCR,循环第三步：引物延伸,靶序列,靶序列,第,1,个,PCR,循环完成后：得到两个拷贝的靶序列,5,/,3,/,G,G,T,C,3,/,5,/,G,A,C,C,5,/,3,/,AG,引物,5,/,3,/,GG,引物,变性,95,复性,55,延伸,72,5,/,3,/,G,G,T,C,5,/,3,/,G,G,T,C,5,/,3,/,GA,引物,5,/,3,/,GA,引物,5,/,3,/,GG,引物,5,/,3,/,GA,引物,3,/,3,/,5,/,G,A,C,C,3,/,5,/,G,A,C,C,5,/,3,/,GG,引物,5,/,3,/,GG,引物,5,/,3,/,GG,引物,3,/,5,/,3,/,GA,引物,循环次数,DNA,数量,1,2,2,4,3,8,20,1,048,576,30,1,073,741,824,3,、,30,次循环后靶序列扩增的数量,4,、,PCR,循环的结果,DNA,聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的,DNA,序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物,延伸而成的,DNA,单链会与引物,结合，进行,DNA,的延伸,五、小结,PCR,仪加热使（）变性,复性使引物与模板,DNA,（）,延伸需将反应温度升至中温,(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过,30,次循环,最终使基因放大了数百万倍,;,模板,互补结合,Taq,聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,考点一 DNA的复制,1,、关于,DNA,的复制，下列叙述正确的是（）,A,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,，只能从,5,端延伸,DNA,链,B,DNA,复制不需要引物,C,引物与,DNA,母链通过碱基互补配对进行结合,D,DNA,的合成方向总是从子链的,3,端向,5,端延伸,2.DNA,的复制需要引物，主要原因是,(),A,可加快,DNA,复制速度,B,引物可与,DNA,母链通过碱基互补配对结合,C,引物的,5,端有助于,DNA,聚合酶的延伸,DNA,链,D,DNA,聚合酶只能从,3,端延伸,DNA,链,3.,引物的作用是,(),A,打开,DNA,双链,B,催化合成,DNA,子链,C,使,DNA,聚合酶能够从引物的,3,端开始复制,D,提供模板,考点二 PCR技术,4,、,PCR,技术控制,DNA,的解聚与结合是利用,DNA,的（）,A,、特异性,B,、稳定性,C,、热变性,D,、多样性,5,、标准的,PCR,技术过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（）,A.92,、,50,、,72,B.72,、,50,、,92,C.50,、,92,、,72,D.80,、,50,、,72,引物,引物,6,、上图是哪次循环的产物（）,A,、第一次循环的产物,B,、第二次循环的产物,C,、第三次循环的产物,D,、第四次循环的产物,考点三 DNA的复制与PCR比较,7,、,Taq,DNA,聚合酶的特点（）,A,、耐强酸,B,、耐强碱,C,、耐高温,D,、最适温度,37,8,、,PCR,技术能快速扩增,DNA,片段，在几个小时内复制出上百万份的,DNA,拷贝，有效地解决了因为样品,DNA,含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：,5-G-GT-C-3 5-G-G-OH(,引物,),3-C-CA-G-5,（引物,）,95,5-G-GT-C-3 3-C-CA-G-5,55,5-G-G-OH,5-G-GT-C-3 3-C-CA-G-5,72,（,1,）在相应的横线上写出引物,，并在复性这一步骤中将引物,指置于合适的位置。,（,2,）在相应的横线上写出循环一次后生成的,DNA,分子。,（,3,）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用,32P,标记，请分析循环一次后生成的,DNA,分子的特点：,（,4,）,PCR,技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。例如它不仅可以用于基因的分离、克隆和序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，,_,的诊断，肿瘤机制的探索，,_,鉴定等诸多方面。,核苷酸,遗传病和传染病,刑事和医学,作业：,思考,:DNA,聚合酶和,DNA,连接酶都能催化两个核苷酸之间形成磷酸二脂键，两者有什么异同,练习,:,课后题及练习册内容,