凝胶色谱法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2003,年,4,月,14,日宣布人类基因组序列图完成,这标志着进入了后基因组时代。,人类基因组：指,DNA,分子所携带的全部,遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,1,专题,5 DNA,和蛋白质技术,2,蛋白质分离的原理：,根据蛋白质,各种特性,的差异，如,分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识,3,（一）凝胶色谱法,2.,凝胶：,大多数凝胶是由,多糖类化合物,（如,葡聚糖,或,琼脂糖,）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质,相对分子质量,的大小，利用具有,网状结构,的凝胶，来进行分离。,1.,概念：,（,分配色谱法,）,4,3.,凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程,5,6,4.,凝胶色谱法的原理,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢,;,相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？,7,（二）缓冲溶液,能够抵制,外界的酸和碱,对溶液,PH,值,的影响，,维持,PH,基本不变。,1.,作用,:,2.,缓冲溶液的配制,:,通常由,1,2,种缓冲剂,溶解于水,中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同,PH,范围内,使用的缓冲液。,3,.,在本课题中使用的缓冲液是,:,磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠,如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？,8,（三）电泳：,1.,概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、,核酸等都具有可解离的基团，在一定的,PH,下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离,。,9,3.,类型,:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙烯酰胺,凝胶电泳。,10,聚丙烯酰胺凝胶电泳,在测定蛋白质分子量时常用,十二烷基硫酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂,N,N,-,亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,11,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决,于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,1.,原理：,SDS,能使蛋白质发生完全变性,。由几条肽链组成的蛋白质复合体在,SDS,的作用下会,解聚成单条肽链,，因此测定的结果只是,单条肽链的分子量,。,SDS,能与各种蛋白质形成,蛋白质,SDS,复合物,，,SDS,所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有的电荷量,。因而掩盖了,不同种蛋白质间的电荷差别,，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,2.SDS,作用机理,:,12,用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法,使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定蛋白质的分子量时，可选用一组,已知分子量的标准蛋白,同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的,电泳区带位置,，可以测定,未知蛋白质,的分子量。,市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,13,14,二、实验操作,样品处理粗分离,纯化,纯度鉴定,蛋白质提取和分离步骤,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（,90,）,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁红素基团,血液有哪些成分？,（一）血红蛋白,15,作业,完成,血红蛋白的提取和分离,蓝皮,5,月,15,日,16,