染色法测细胞周期.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,PI,染色法测细胞周期,1,一）细胞,DNA,含量检测,细胞固定后用,PI,（,Propidium iodide,碘化丙啶），,染色，因为,PI,特异性结合于细胞,DNA,，荧光强度与,PI,的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的,DNA,含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。,2,3,单参数直方图,图中,2N,代表,G0/G1,期细胞，,4N,代表,G2/M,期细胞，两者中间代表,S,期细胞。这是以,2,倍体和,4,倍体细胞为主的流式,DNA,图,4,DNA,细胞周期分析,细胞周期,G,2,M,G,0,G,1,s,200,400,600,800,1000,G,0,G,1,s,G,2,M,DNA,分析,DNA,含量,细胞数量,2N,4N,5,6,2,倍体,异倍体,4,倍体,肿瘤组织中的各种,DNA,倍体,7,含量与凋亡关系,DNA,亚,G1,峰的检测：利用,PI,染色，检测具有亚,G,1,期,DNA,含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。,凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将,DNA,降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的,DNA,片段从细胞内流出，造成总体,DNA,含量减少，成为亚,2,倍体。,8,9,10,2.,凋亡研究,在,G,0,/G,1,峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。,检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。,11,12,Annexin V Assay,13,图,Annexin V/PI,双标记分析细胞凋亡和坏死,14,Date acquired:14-Jan-03,File:7Gy 4hr.001,Source:dongbo,DIPLOID:100.00%,Dip G0-G1:73.12%at 48.16,Dip G2-M:9.59%at 96.33,Dip S:17.29%G2/G1:2.00,Dip%CV:6.04,Apoptosis:13.66%Mean:27.48,图,FCM,测试细胞周,期分布和凋亡,15,根据凋亡细胞的特点来检测,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏,凋亡细胞的,FSC,？,SSC,？,细胞坏死时，细胞肿胀，,FSC,？，,SSC,？,16,正常人静止体细胞有,46,条染色体，相当于,7.10-12 pg DNA/,细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的,DNA,含量。在细胞周期,(G0,，,G1,，,S,，,G2,，,M),的各个时期，,DNA,含量随各时相呈现出周期性的变化：在,G1,期，细胞开始,RNA,和蛋白质的合成，但,DNA,含量仍保持二倍体,；,17,进入,S,期后，,DNA,开始合成，这时细胞核内,DNA,的含量介于,G1,和,G2,期之间；当,DNA,复制结束成为,4,倍体时，细胞进入,G2,期，,G2,期细胞继续合成,RNA,及蛋白质，直到进入,M,期，因此，单纯从,DNA,含量无法区分,G2,期和,M,期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期,(G0,期,),，而,G0,期从,DNA,含量上同样无法与,G1,期区分。因此，,整个复制周期可以描述为,G0/G1,，,S,，,G2/M,期。,18,19,通过核酸染料标记,DNA,，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出,G0/G1,，,S,及,G2/M,的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合,DNA,指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。,20,G,2,M,G,0,G,1,s,0,200,400,600,800,1000,G,0,G,1,s,G,2,M,DNA Analysis,DNA content,Count,2N,4N,Normal Cell Cycle,21,细胞浓度及质量要求,单细胞和核的上机浓度应约,10,6,/ml,。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的,CV,。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响,CV,和检测结果。,制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片,。,22,染料的选择取决于流式激光的配置。,488nm,的激光下应用,PI(,碘化丙啶,),，由于,PI,也与,RNA,结合，所以分析前样本应用,Rnase,处理,.,。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。,PI,的推荐浓度是至少,20ug/10,6,个细胞。其最佳浓度为,50ug/10,6,个细胞。,23,操作步骤,取一瓶生长期的,A549,细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入,3mlPBS,，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入,1ml,胰蛋白酶消化,15,分钟（以镜下观察决定）,加入,5mlPBS,轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至,15ml,离心管中,1500rpm,离心,5min,，去上清。,加入,500ulPBS,轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在,旋涡状态下逐滴加入,2ml-2095%,冷乙醇，混匀后固定,30min,。,24,加入,5mlPBS,，,1500rpm,离心,5min,，去上清液。,加入,5mlPBS,重悬细胞，,1500rpm,离心,5min,，去上清液。,加入,800ulPI,染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色,30min,上机检测。,25,影响荧光染色的因素,温度：温度高于,20,时，即出现温度淬灭。,2,、,PH,：,PI,在,7.27.6,，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。,3,、荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。,4,、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。,26,