PCR技术原理及其应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PCR,技术原理及其应用,1 PCR,技术原理,2 PCR,技术应用,2,第一节,PCR,技术原理,3,一、,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,4,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA,引物,RNA,引物,5,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,6,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,7,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,1985,年，美国,PE-Cetus,公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,基本原理是在试管中模拟细胞内的,DNA,复制,最初采用,E-coli DNA,聚合酶进行,PCR,，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热,DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等因此项技术获诺贝尔化学奖,8,Kary B.Mullis,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首,比喻,1989,年为,PCR,爆炸年,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,9,引物,引物,Mullis,的构思,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,特定,DNA,片段,10,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,11,72,94,55,PCR,循环,12,二、,PCR,的基本原理,类似于,DNA,的体内复制。首先待扩增,DNA,模板加热,变性,解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生,退火,，再将温度升高使退火引物在,DNA,聚合酶作用下得以,延伸,。这种热变性,-,复性,-,延伸的过程就是一个,PCR,循环，,PCR,就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,13,PCR Cycle-Step 1,-Denaturation Template DNA by Heat(95,o,C),Target Sequence,Target Sequence,PCR,原理示意图,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,14,PCR Cycle-Step 2,Temperature is lowered(T,m,)and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,15,PCR Cycle-Step 3-,At 72,o,C,Taq,DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,Polymerase,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链。,16,End of the 1st PCR Cycle,Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,17,Target Amplification,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,1,cycle=2 Amplicon,2,cycle=4 Amplicon,3,cycle=8 Amplicon,4,cycle=16 Amplicon,5,cycle=32 Amplicon,6,cycle=64 Amplicon,7,cycle=128 Amplicon,18,三、,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的,PCR,反应条件：,10X,缓冲液,10,L,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0.1,2,g,Taq DNA,聚合酶,2.5U,Mg,2+,1.5mmol/L,19,PCR,仪,20,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,21,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,22,模板,DNA,95,23,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,24,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,25,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,26,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,27,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,28,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,理想拷贝数,=2,n,n,循环次数,实际拷贝数,=(1+x),n,X,平均效率,约为,0.85,n,循环次数,29,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,30,以,DNA,为模板的反应,反应体积：,50100l,缓冲液,引物,底物：,4,种,dNTP,模板：,10,2,10,5,拷贝,TaqDNA,聚合酶,矿物油,四、,PCR,反应体系,31,以,mRNA,为模板的反应（逆转录,PCR,）,逆转录反应体系,体积：,20 l,缓冲液,底物：,4,种,dNTP,引物：,oligo(dT)1218,模板：,RNA,逆转录酶,其他试剂：,RNA,酶抑制剂，,MgCl,2,.DTT.,牛血清白蛋白,PCR,反应体系同以,DNA,模板的反应体系,32,（一）,PCR,反应成分,（,1,）模板,单、双链,DNA,均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,（,2,）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。,（,3,）,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,34,（,4,）,dNTP 20200mol/L,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,（,5,）,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,36,1050mmol/L Tris-Cl,缓冲液，,72,时,pH 7.2,调节反应体系的,pH,值，使,Taq DNA,聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含,50 mmol/L,的,KCl,可促进引物退火，大于此浓度将会抑制,TaqDNA,聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,（,6,）,PCR,反应的缓冲液,37,（二）循环参数,（,1,）变性,94,o,C,95,o,C,，,30-60 s,且最初在加,Taq,酶之前先于,97,o,C,充分变性,5,10,min,（,2,）退火,50,o,C,55,o,C,，,60-90 s,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,38,（,3,）,延伸,70,o,C,74,o,C,，,60-120,s,延伸时间由扩增片段长度决定,（,4,）,循环次数,主要取决于模板,DNA,的浓度，一般为,25-35,次,次数过多：非特异扩增增加,39,（三）,PCR,产物的积累规律,在,PCR,反应中，,DNA,扩增过程遵循酶的催化动力学原理。,反应初期，目的,DNA,片段呈指数扩增。随着目的,DNA,产物逐渐积累，扩增,DNA,片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需,PCR,循环次数取决于样品中模板的拷贝数、,PCR,扩增效率、,DNA,聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，,TaqDNA,聚合酶一般要进行,25,次以上,PCR,循环。,多数情况下，平台期在,PCR,反应中不可避免。,40,PCR,产物的积累规律示意图,41,（一）一般原则,引物长度在,15,30,碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。,引物中碱基的分布是随机的，避免,4,个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，,G+C,含量宜在,45,55,左右。,五、,PCR,引物的设计,42,避免两引物间的互补，特别是,3,端互补，以免形成二聚体。,引物自身不应存在连续超过,3bp,的互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。,43,引物的,3,端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。,引物的,5,端限定着,PCR,产物的长度，可根据产物的要求不同，可以选用不同的引物修饰法。,引物与非扩增序列的同源性不应超过,70,。,44,直接提交模板序列到特定网页。,如：,genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer,;,frodo.wi.mit.edu/,引物设计软件。功能：首先是引物分析评价功能，其中以“,Oligo 6”,最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。,（二）引物设计的方法,45,六、,PCR,产物的检测,（一）琼脂糖凝胶电泳,是,PCR,扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。,其分辨率很高，可测出,1ng DNA,。,一般,800bp,以上的片段用,0.8%,的胶，,800bp,以下的片段用,1.0%,2.0%,的胶。,46,灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高,，主要用于分离制备小于,1kb,长度的低分子质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。适用于,PCR,扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比,EB,染色检测灵敏度高,2,10,倍。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳,47,高效液相色谱,(HPLC),是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。,离子交换层析（,IEC,）的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，,IEC,分析广泛应用于,DNA,的合成及其扩增后的分离纯化。,（三）层析技术,48,为了确定,PCR,产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和,Southern,印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的,PCR,扩增产物分析。,Southern,印迹杂交可鉴定,PCR,产物的大小和特异性，检测灵敏度可达,10ng,。基本过程是,PCR,产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。,（四）分子杂交,49,若知道,PCR,扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化,PCR,产物，再进行电泳分析，根据,PCR,酶切产物的电泳图谱，可判定,PCR,产物的特异性及是否存在突变。,（六）,PCR,扩增产物的直接测序,直接序列分析是指在,PCR,扩增基因组,DNA,序列的基础上，直接进行基因核苷酸序列分析的方法，是检测基因突变最有效、最直接的方法。,（五）限制性内切酶酶切分析,50,七、,PCR,中应注意的事项,（一）防止污染,试剂小量分装,吸头及,Ep,管一次性使用,器皿及工作区域要分开，无菌操作,（,二）设立对照,：,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,八、,PCR,常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,52,第二节,PCR,技术应用,53,一、,PCR,技术的主要类型,反向,PCR,锚定,PCR,不对称,PCR ,原位,PCR,RT-PCR,重组,PCR,差异显示,PCR,免疫,PCR,实时定量,PCR,多重,PCR,54,1),反向,PCR(reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的,DNA,片段，对某个已知,DNA,片段两侧的未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知,DNA,片段的序列；用于仅知部分序列的全长,cDNA,的克隆,扩增基因文库的插入,DNA,；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,55,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,56,2,）不对称,PCR,目的：扩增产生特异长度的单链,DNA,。,方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是,0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。,用途：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组,DNA,结构功能的研究,57,高浓度引物,低浓度引物,58,3,）,RT-PCR,是以反转录的,cDNA,作模板所进行的,PCR,反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现,mRNA,多态性,克隆,mRNA,的,5,和,3,末端序列，以及从非常少量的,mRNA,样品构建大容量的,cDNA,文库。,59,mRNA,cDNA,杂化双链,逆转录酶,聚合酶,PCR,扩增,60,基因,mRNA,蛋白质多肽链,61,4,）多重,PCR,：,在一个反应体系中使用一对以上引物的,PCR,称为多重,PCR,。其结果是产生多个,PCR,产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,62,5,）实时荧光定量,PCR,real-time PCR,，,美国,PE,（,Perkin Elmer,）公司,1995,年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规,PCR,基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通,PCR,相比，实时定量,PCR,具有许多优点。,63,原理和方法,利用,Taq,酶的,5,3,外切酶活性，在,PCR,反应系统中加入一个荧光标记探针,。该探针可与引物包含序列内的,DNA,模板发生特异性杂交，,探针的,5,端标以荧光发射基团,FAM,（荧光发射峰值在,518nm,处），,靠近,3,端标以荧光淬灭基团,TAMRA,（荧光发射峰值在,582nm,处），探针的,3,端被磷酸化以防止探针在,PCR,扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，,淬灭基团抑制发射基团的荧光发射,。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，,518nm,处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板,DNA,发生杂交，延伸期,Taq,酶,随引物延伸沿,DNA,模板移动，,当移动到探针切断,淬灭作用被解除,，荧光信号释放出来,.,模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于,被释放的荧光基团数目和,PCR,产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。,64,实时,PCR,技术原理,65,荧光探针设计遵循原则：,探针长度应在,20,40,个碱基左右，保证结合特异性。,GC,碱基含量在,40%,60%,，避免单核苷酸序列的重复。,避免与引物发生杂交或重叠。,探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的,Tm,值要比引物的,Tm,值至少高出,5,。,另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。,66,特 点,FQ-PCR,不仅具有普通,PCR,的,高灵敏性,，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测,PCR,扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有,DNA,杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,，克服了常规,PCR,的许多缺点。,FQ-PCR,只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要,PCR,后处理，避免了常规,PCR,操作中的诸多弊端。,67,1,病原体测定,由于,PCR,技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，,PCR,扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规,PCR,由于不能定量而限制了其应用，然而,PE,公司研制的,FQ-PCR,技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。,Morris,等用,FQ-PCR,对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（,HCV,）进行了研究。,FQ-PCR,技术在保持巢式,PCR,高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测,HCV,的有效方法。同时，由于,FQ-PCR,可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。,68,以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的,PCR,后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国,Witham,等,1996,年将,FQ-PCR,技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于,TaqMan,系统可以一次测量,96,管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电泳及,EB,染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。,69,2.,肿瘤研究,意大利,Gelmini,等用,FQ-PCR,技术检测乳腺癌标本,c-erbB-2,基因拷贝数目变异情况。他们以,-,肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在,28,31,之间时，,RQ,与模板,DNA,有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了,c-erbB-2,基因和,-,球蛋白基因，发现,RQ,都与各自的模板,DNA,浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的,RQ,之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与,Southern,印迹结果和已报告的竞争性,PCR,结果比较都显示高度相关性（,n=25,，,r=0.94,，,P0.01,）。,70,3.,基因表达研究,由于,TaqMan,系统及荧光探针的应用，对,mRNA,的检测显得较以前常用的方法如,Northern,印迹、,RT-PCR,定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（,TPO,）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（,ITP,）、再生障碍性贫血（,AA,）和特发性血小板多症（,ET,）等疾病过程中的病理生理意义，日本,Hirayama,等用,TaqMan EZ RT-PCR,试剂盒在,ABI7700,反应系统测定了正常人和,ITP,、,AA,、,ET,病人的骨髓基质细胞,TPO mRNA,水平，又用,ELISA,方法测定了骨髓和末梢血的,TPO,浓度。结果显示,ITP,和,AA,病人,TPO mRNA,水平明显升高，而,ET,病人的,TPO mRNA,水平则正常，经类固醇治疗后,ITP,病人,TPO mRNA,水平下降；骨髓,TPO,的浓度与其,mRNA,水平有相关性；在正常人和,ITP,病人，,TPO mRNA,表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明,TPO,的作用提供了依据。,71,4.,免疫组份分析,对免疫,T,细胞群体,V-,组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或,RFQ-PCR,法来进行。,1997,年,Lang,等用,FQ-PCR,技术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的,V-,成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。,72,5.,基因突变及多态性的研究,美国,Ibrahim,等,1997,年用,FQ-PCR,技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一,DNA,片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒,DNA,疫苗的单核苷酸变异多态的研究。,73,6.,其他方面,日本,Isono,利用,FQ-PCR,进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因,Cab,作为内参照，进行叶绿体基因,rbc1,拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。,1998,年美国,Higgins,等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（,pla,）的实验方法。,74,综上所述，,FQ-PCR,作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。,75,二、,PCR,技术应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,课件部分内容来源于网络，如对内容有异议或侵权的请及时联系删除！,此课件可编辑版，请放心使用,！,