第四章细胞培养与代谢调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 细胞培养与代谢调控,一、细胞培养概述,细胞培养是指从体内组织分离细胞，模拟体内环境，在无菌、适当条件下使其生长繁殖一种技术。细胞培养的对象是单个细胞或细胞群。,细胞培养影响的环境因素：营养、,pH,、渗透压、溶解氧、光照、剪切力等。,1,、细胞培养发展简史及有关概念,1907,年，美国生物学家哈里森将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周，并观察了神经突起的生长现象。被称为“细胞（组织）培养之父”。,Carrel1912,年提出无菌操作技术，,1923,年又设计了卡氏培养瓶。,现在，细胞培养技术已经成为现代医学研究中的一项重要的手段。近年来，细胞培养技术在细胞生物学、分子生物学、遗传学、药理学、免疫学、老年学、肿瘤学和病毒学以及临床各学科领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕成果。,1,）细胞培养（,cell culture,）,是指将组织取出后，用化学或物理的方法，将其分散成单个细胞在体外条件下进行培养。细胞在培养的过程中不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群。,从广义上讲，体外,(in vitro),培养包括所有结构层次的培养，即器官培养、组织培养和细胞培养。,2),组织培养（,tissue culture,）,指从体内取出组织，在体外模拟体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能。培养物是组织碎块或器官的一部分。,3,）器官培养（,organ culture,）,指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能。,实际上，在体外培养时，无论采用什么方法和条件，培养的主要成份仍然是细胞。另外，细胞培养也并不意味着细胞彼此是独立的，细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存，呈现一定的“组织”特性。所以组织培养和细胞培养并无严格区别，常用作同义语使用。,4,）原代培养,(primary culture),将机体取出的细胞或组织进行实效（立即）培养的过程，又称初培养。初培养的细胞大约增殖,10,代左右，这样的细胞称为,原代细胞,。,5,）传代培养,(passage culture),指从原代培养的细胞继续转接培养，又称继代培养。,6,）细胞系（,cell line,）,由原代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群即成细胞系。此时细胞发生了遗传突变，染色体呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制特性。,目前常用的细胞系有：,3T3,（小鼠胚胎成纤维细胞）；,CHO,（正常中国仓鼠卵巢细胞）；,L,（小鼠肿瘤细胞）；,BHK,（叙利亚仓鼠肾）；,Hela,（人宫颈癌细胞,),7,）细胞株（,cell strain,）,原代培养细胞能顺利传代，且保持原来染色体的二倍体数量和接触抑制行为，把这种传代细胞称为细胞株。,8,）克隆（,clone,）,又称无性繁殖系或无性系，指由一个细胞或共同祖先通过有丝分裂所产生的遗传特性一致的细胞群或生物群，亦指,DNA,片段群,二、细胞培养的操作方式,根据细胞培养时营养成分添加以及培养液与细胞收集方式的不同，细胞培养有：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌流式,5,种操作方式。,3,、半连续式培养,半连续式培养又称重复分批式培养或换液培养在细胞增长和产物形成过程中，每隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原体积，是反应期内的总体积不变。每次稀释培养体积的,1/23/4,。,特点：,（,1,）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间。,（,2,）可进行多次收获。,（,3,）操作简便，生产效率高。,4,、连续式培养,连续式培养是在细胞达最大浓度以前，以一定速度向反应器连续添加新鲜培养液，同时含有细胞的培养液以相同速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定的培养方式。,特点：,（,1,）细胞能在恒定状态下生长，营养物质浓度、产物浓度、,pH,基本卡保持恒定细胞浓度以及生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数生长。,（,2,）稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。,5,、灌流式培养,灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地取出部分培养液，同时又连续不断地补充新的培养液。与连续式操作的不知处在于取出培养液时，细胞均保留在生物反应器内。,特点：,（,1,）细胞截留系统可使细胞保留在生物反应器内，维持较高的细胞浓度。,（,2,）能使细胞处在较稳定的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低。,（,3,）反应速率容易控制，培养周期长，可提高生产效率，目标产品回收率高。,（,4,）产品在反应器内停留时间短，可及时回收，有利于保护产品的活性。,三、细胞培养动力学,细胞培养动力学（dynamics of cell cultivation）：是研究细胞生长、基质消耗以及产物生成规律的科学，包括细胞生长动力学、基质消耗动力学以及产物生成动力学。,分批培养生长动力学,在分批培养过程中，细胞生长过程主要包括：延迟（适应）期、指数生长期、减速期、平台期和衰退期5个阶段,延迟期,指数生长期,减速期,S:限制性基质浓度 Ks:饱和常数,:比生长速率 m:最大比生长速率,平台期,Xm:最大细胞浓度;Xo:接种时的细胞浓度,So:限制性基质接种时的浓度;m:最大比生长速率,K:常数,四、细胞代谢与调控,代谢产物关系,糖类代谢与脂肪代谢之间的关系，糖类与蛋白质代谢之间的关系，脂肪代谢与蛋白质代谢之间的关系，核酸代谢与糖、脂肪、蛋白质三者之间的关系,代谢工程,逆代谢工程,2025年12月12日,21,生物大分子：,糖、脂类、蛋白质,蛋白质和脂类代谢取决于糖代谢的程度,第二节 物质代谢的相互关系,TCA,：糖、脂肪和蛋白质三大物质互相转化的枢纽,物质代谢,-,联系,-,转化,关键代谢物：,如,G-6-P,，丙酮酸、乙酰辅酶,A,2025年12月12日,22,一、糖代谢与蛋白质代谢的相互关系,1,）,蛋白质,AA,，生糖,AA-,酮酸糖,（多数）,AA,脱氨,丙酮酸,糖异生,糖,2025年12月12日,23,2,）,糖,非必需,AA,，但不能合成必需,AA,糖代谢：,为,Pr,合成提供碳源和能源,2025年12月12日,24,2,、糖代谢与脂类代谢的关系,饥饿：与糖尿病类似的情况,2025年12月12日,25,3,、脂类代谢与蛋白质代谢的关系,脂类分解产生较多的能量,体内贮藏能量的物质,脂类与蛋白质之间可以相互转化,2025年12月12日,26,4,、核酸代谢与糖、脂肪及蛋白质代谢的关系,Gly,、,Asp,、,Gln,嘌呤、嘧啶,AMP,辅酶、组氨酸等,蛋白酶,核苷酸、核酸的合成,一碳基团,核苷酸、核酸的合成,2025年12月12日,27,酮体,CO,2,尿素,2025年12月12日,28,大分子降解成基本结构单位（构造单元）,构造单元形成共同的中间产物（如,丙酮酸、乙酰,CoA,等），产生,NADPH,、,ATP,中间物进入,TCA,彻底氧化,H,2,O,、,CO,2,，产生大量,ATP,2025年12月12日,29,第三节、代谢调控总论,代谢调节的三级水平：,细胞,/,酶水平调节,激素水平调节,神经水平调节,多细胞整体水平调节,代谢物通过影响细胞内酶活力和酶合成量的变化，改变合成或分解代谢过程的速度,内分泌腺所分泌的激素通过体液输送到一定组织，作用于靶细胞，改变酶活性而调节代谢反应的方向和速度。,CNS,的控制下，通过神经递质对效应器发生直接影响，或者改变激素的分泌。,2025年12月12日,30,一、酶水平的调节,酶水平调节,酶活性调节,（酶结构调节）,变（别）构调节,快速调节,（微调）,酶合成的诱导与阻遏,长期调节,（粗调节）,酶含量调节,（基因表达水平调节）,化学修饰调节,酶的降解,（一）酶活力的调节,2025年12月12日,31,别构效应物,别构激活剂,别构激活（正反馈）,增加活性,别构抑制剂,别构抑制（负反馈）,降低活性,底物、产物,或,ATP,、,ADP,、,AMP,等,1,反馈抑制：限速酶受其代谢体系终产物的抑制。,2025年12月12日,32,2025年12月12日,33,代谢物,别构中心,活性中心,反馈调节中酶活性调节的机制,2025年12月12日,34,氨基酸合成的反馈调控,反硝化作用,氧化亚氮,氨甲酰磷酸,分支酸,脱氧庚酮糖酸,-7-,磷酸,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,赤藓糖,-4-,磷酸,脱氢奎尼酸,莽草酸,谷氨酸,磷酸烯醇式丙酮酸,+,预苯酸,Try,Phe,Trp,Ile,Trp,His,CTP,AMP,Gln,Lys,Met,Thr,酮丁酸,Gly,Ala,谷氨酰胺合酶,天冬氨酰半醛,高丝氨酸,氨基苯甲酸,协同反馈抑制,顺序反馈抑制,2025年12月12日,35,2,、产能反应与需能反应的调节,细胞能量状态指标,0.85,0.95,能荷,0.85,，产能（分解）代谢加强,能荷,0.95,，贮能（合成）代谢加强,糖原,葡萄糖,CO,2,H,2,O,ATP,3,2,1,ATP,、,ADP,、,AMP,也是一种变构剂,2025年12月12日,36,丙酮酸,G,细胞液,柠檬酸,乙酰,CoA,柠檬酸,草酰乙酸,-,酮戊二酸,乙酰,CoA,丙酮酸,线粒体,G-6-P,F-6-P,F-1.6-2P,磷酸果糖激酶,PEP,ADP+Pi ATP,ADP+Pi ATP,NADH,O,2,ATP,ADP+Pi,AMP+ATP 2ADP,Pi,Pi,PEP,羧激酶,+,+,+,-,-,-,+,+,-,-,-,-,己糖激酶,丙酮酸脱氢酶,柠檬酸合成酶,-,酮戊二酸,脱氢酶,糖酵解与,TCA,途径的调节,2025年12月12日,37,3,、酶的共价修饰和级联系统,（,1,）共价修饰,（,covalent modification,）：,酶蛋白肽链上的基团在另一些酶的催化下可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这种改变酶活性的调节方式,（,2,）共价修饰的类型：,磷酸化,/,去磷酸化,（最常见），乙酰化,/,去乙酰化,腺苷酰化,/,去腺苷酰化，尿苷酰化,/,去尿苷酰化,甲基化,/,去甲基化，氧化（,S-S,）,/,还原,(2SH),2025年12月12日,38,2025年12月12日,39,（,3,）特点,修饰过程，酶活性在,无活性,（低活性）与,有活性,（高活性）,两种状态中,互变,共价修饰互变由,不同的酶催化,快速,调节,激素信号启动的共价修饰会引起,级联放大效应,2025年12月12日,40,糖原磷酸化酶和糖原合成酶活性的调节,2025年12月12日,41,受共价修饰调节的酶,酶,来源,改变反应,对酶活力的影响,糖原磷酸化酶,真核细胞,磷酸化,/,脱磷酸化,+/-,磷酸化酶,b,激酶,哺乳类,磷酸化,/,脱磷酸化,+/-,糖原合成酶,真核细胞,磷酸化,/,脱磷酸化,-/+,丙酮酸脱氢酶,真核细胞,磷酸化,/,脱磷酸化,-/+,谷氨酰胺合成酶,原核细胞,(,大肠杆菌,),腺苷酰化,/,脱腺苷酰化,-/+,2025年12月12日,42,（,4,）,级联系统,（,cascade system,）：,连锁代谢反应中一个酶被激活后，连续地发生其它酶被激活，导致原始信号的放大,级联系统。,肾上腺素,膜受体，效应器活化，引发一系列胞内连锁反应,2025年12月12日,43,意义,：,由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式,快速、效率极高。,2025年12月12日,44,4,、酶原与酶原激活,酶原：,某些酶的无活性前体蛋白,酶原激活：,无活性的酶原形成活性酶的过程,实质：,活性中心的形成或暴露过程,常见形式：,切下一段多余的肽段,2025年12月12日,45,胃蛋白酶原的激活,2025年12月12日,46,胰蛋白酶原的激活及其功能,胰蛋白酶原,六肽,肠激酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶原,胰凝乳蛋白酶,弹性蛋白酶原,弹性蛋白酶,羧肽酶原,羧肽酶,水解,Arg Lys,羧基形成的肽键,2025年12月12日,47,（二）酶量的调节,酶蛋白合成，降解的调节,增加酶量：增加合成，减少降解,减少酶量：抑制合成，促进降解,以基因水平为基础的调节,2025年12月12日,48,1.,酶蛋白合成,：,底物诱导,产物阻遏,激素诱导,药物诱导,乳糖操纵子,色氨酸操纵子,2025年12月12日,49,2.,酶蛋白的降解,蛋白水解酶存在于溶酶体,酶蛋白的降解远不如酶的诱导和阻遏重要,泛素：与待降解的蛋白结合，由蛋白酶体进行降解,思考题,名词：细胞培养,细胞培养的操作方式有哪些？,在分批培养中，细胞生长分哪几个阶段？,