产前诊断中绒毛脐血羊水取样及标本培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,产前诊断中心,南京鼓楼医院,*,产前诊断中绒毛脐血羊水取样及标本培养,产前诊断指征,夫妇任一方有染色体异常；,曾生育过染色体病患者；,夫妇任一方为单基因病患者；,曾生育过单基因病患者；,有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史；,产前诊断指征,羊水过多的孕妇；,夫妇任一方曾接触致畸因素；,孕妇年龄大于,35,岁；,有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。,产前筛查高风险的孕妇,超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇,产前诊断的方法,羊膜腔穿刺取样（,amniocentesis,）,绒毛穿刺取样（,chorion villus sampling,cvs,）,脐带血取样（,periumbilical cord blood sampling,PUBS,）,植入前诊断（,preimplantaton genetic diagnosis,PGD,）,产前诊断的方法,胎儿组织取样（皮肤、肝脏）,胎儿镜（,fetoscope,）,胚胎镜（,embryoscope,）,胎儿超声波图象（,fetal ultrasound imaging,）,母体外周血胎儿细胞检测（,cell-storing,）,绒毛穿刺取样,历史,1975,年 我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世（经宫颈盲吸法，准确率,95%,，自然流产率,9.3%,，出生婴儿未发现异常）,莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）,1983,您,Ward,和,Brambati,分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析,绒毛穿刺取样,时间,妊娠,911,周,绒毛穿刺取样,抽取量,20mg,左右（染色体核型分析约需,10mg,，,DNA,分析约需,5mg,，生化测定约需,5-10mg,）,绒毛穿刺取样,并发症,胎儿丢失,胎儿肢体发育缺陷（,LRD,）,CVS,并发症,胎儿丢失,CVS,的流产率不比,amniocentesis,高,经宫颈和经腹取样安全性相同（,Jackson,1992,）,多胎取样高于单胎取样（,Pergament,1992,）,CVS,并发症,LRD,1999,年,WHO,发布,CVS,综合性资料认为,CVS,与,LRD,无关（,216,，,381,例,CVS,中,115,例出现,LRD,发生率,1,：,1881,，总的人群发生率,1,：,1642,）,世界各地相关资料综合，,9,周以下,CVS,出现,LRD,的机会高，但原因尚不清楚,CVS,不应在小于孕,10,周的条件下进行,绒毛穿刺取样,方法,经宫颈（,transcervical,）,经腹（,transabdorminal,）,CVS,方法,经宫颈取样,B,超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪，经腹探头频率3.5,MHz,经阴道探头频率5-7,MHz。,采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外径1.4,1.6,mm,长20,cm,带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。,导管另一端连接,10-20ml,含有,2-4ml,生理盐水的注射器,CVS,方法,经腹取样,双针活检系统由1根长15,cm、,外径1.2,mm,的18号引导套针，及1根长20,cm、,外径0.8,mm,的22号活检针组成。,在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织,连接含2-4,ml,生理盐水的20,ml,注射器，以5,ml,的负压上下移动活检针吸取绒毛组织,CVS,注意事项,动作要轻柔,穿刺部位在胎盘绒毛叶,抽吸次数不宜过多,羊膜腔穿刺,历史,1956,年,Fucks,进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿,Rh,溶血诊断,1966,年,Mark steele,和,Roy Breg,从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析,羊膜腔穿刺,时间,1620,周,羊膜腔穿刺,抽取量,20,30ml,抽取的羊水用途,核型分析,诊断染色体病,DNA,分析,诊断单基因病,生化测定,诊断,NTD,、代谢性疾病,羊水穿刺,穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部,超声波定位引 导,采用,22,号或,21,号带芯长腰穿刺针头,垂直、快速进针,抽取羊水,2ml,弃置，换空针抽取羊水,羊膜腔穿刺,并发症,胎儿丢失,羊膜腔感染,羊水渗漏,穿刺部位的出血、血肿,羊穿并发症,-,胎儿丢失,1976,年，,Nihd Registry,报道流产率,3.5%,1986,年，,Tabor et al,报道流产率,1.7%,1995,年，,Bombard et al,报道流产率,1.3%,2000,年,Antsaklis,报道流产率,2.1%,脐带血穿刺,历史,1972,年，,Valenti,用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。,1979,年，,Rodeck,和,Campell,应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。,1983,年，,Ternand Daffos,超声引导下经皮脐血管穿刺取血（,Cordocentesis,）,脐带血穿刺,时间,16,周,分娩（最佳,24,28,周）,脐带血穿刺,取血量,3,5ml,20,周后抽取,6,8ml,对胎儿循环无不良影响,脐带血穿刺,适应症,胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的,FGR,、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性,X,综合症等）,胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）,胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）,胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）,遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）,胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）,脐带血穿刺,并发症,穿刺部位的出血,脐带血肿,短暂性胎心减慢,宫内感染,胎儿丢失（流产、早产）,大多数并发症为短暂性和非致命性,脐带血穿刺并发症,胎儿丢失,Maxwell 1991,年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为,1%,（,1/76,）；异常超声者流产率为,7%,（,5/76,）；胎儿结构明显异常者流产率为,25%,（,9/36,）,Antsaklis 1998,年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率,1%,（,2/191,）；异常超声者流产率为,13%,（,11/84,）,脐带穿刺部位,脐血穿刺,确定胎儿血样,血红蛋白电泳,Kleihauer-Betke,试验：胎儿红细胞在酸中稳定,APT,试验：,N,a,OH,中胎儿血为粉红色,有核红细胞的出现,脐血穿刺,排除脐血中母血污染,X,染色体,DMD,基因内部,5,对,CA,重复序列的连锁分析,绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养,绒毛组织的培养,直接法,培养法（悬浮培养、贴壁培养）,绒毛组织的染色体检查,直接法,孕早期,Langhans,细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速,绒毛组织的染色体检查,直接法,绒毛组织的分离洗脱,加秋水仙素（终浓度,2ug/ml,，可一次加，也可分次少量加）,37,O,C 5%CO,2,培养箱培养,45,分钟,低渗（,1%,枸橼酸钠低渗,10,分钟或,1%,枸橼酸钠和,0.075mol/l 1,：,1,低渗,40,分钟）,预固定（甲醇：冰醋酸,3,：,1,）,10,分钟,固定（甲醇：冰醋酸,3,：,1,）,10-20,分钟,冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）,制片,绒毛组织的染色体检查,悬浮培养法,绒毛挑选洗脱,绒毛组织剪成小块入培养瓶（,25ml,培养瓶每瓶,10mg,）,加特定培养液,3ml,培养,3-6,天,收获（加秋素、低渗、固定、制片）,绒毛组织的染色体检查,贴壁培养法,绒毛组织挑选洗脱,绒毛组织剪成小块,加,0.25%+0.02%EDTA 5ml 37,O,C,摇床中,20,分钟,加培养基终止消化，离心后弃上清加培养基接种培养,5-10,天,收获,羊水细胞培养,细胞类型,成纤维样细胞（,F,细胞）,上皮样细胞（密集型上皮样细胞,-E,细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）,羊水样细胞（,AF,细胞）,羊水细胞培养,收获方法,原位法,消化法,刮取法,羊水细胞培养中存在的问题,污染,细菌,真菌,支原体,病毒,其他细胞,羊水细胞培养中存在的问题,母体细胞污染,若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体,母体细胞在培养中占优势,羊水细胞培养中存在的问题,母体细胞污染的预防,羊水穿刺时，把最先抽得的,1-2ml,羊水弃掉,染色体多态现象的测试,羊水细胞、母体细胞 的,HLA,组织定型鉴别,羊水细胞培养中存在的问题,细胞不生长、不贴壁,最常见的原因是支原体污染,培养基,PH,不适当，偏酸（,6.4,或偏碱,7.4,均不利,最合适的穿刺时间,16-20,周,羊水细胞培养中存在的问题,细胞及染色体收获少,每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞）,滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别,操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消化的时间,羊水中胎脂多时,3-5,天可轻轻动一动，减少胎脂贴壁占据空间,低渗时间短于外周血（一般,3-5,分钟）,脐带血细胞培养,量少于外周血（一般,5ml,注射器小于,14,滴）,其他同外周血,Thanks!,