DNA提取方法和步骤.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA提取方法和步骤,实验原理,植物,DNA,的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对,DNA,提取一般有三个要求：,1.DNA,的纯度可以满足下游操作的要求,2.DNA,必须完整,3.DNA,应当有足够的量,构建基因组文库，初始,DNA,长度必须在,100kb,以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。,RFLP,和,PCR,分析，,DNA,长度可短至,50kb,，在该长度以上，可保证酶切后产生,RFLP,片段,(20kb,以下,),，并可保证包含,PCR,所扩增的片段,(,一般,2kb,以下,),。,如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。,核酸的理化性质,RNA,和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，,DNA,则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。,DNA,、,RNA,和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，,RNA,钠盐在水中溶解度可达,40g/L,。,DNA,在水中为,10g/L,，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，,DNA,、,RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白,(DNP),形式存在于细胞核中。要从细胞中提取,DNA,时，先把,DNP,抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去,RNA,及无机离子等，从中分离,DNA,。,核酸的提取方法,提取植物,DNA,的方法主要采用,SDS,和,CTAB,法，对它们进行稍加修改就可以应用于,DNA,的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护,DNA,不受内源核酸内切酶降解。,具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的,SDS,溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。,EDTA,抑制,DNA,酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的,DNA,溶液经乙醇沉淀。,实验材料和试剂,实验材料：新鲜植物组织。,100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),50mmol/L EDTA,500 mmol/L NaCl,1.5%SDS,DNA,提取缓冲液,实验所需试剂：,24:1/,氯仿,:,戊醇,其它试剂：液氮、,TE,缓冲液，无水乙醇、,70%,乙醇。,2CTAB buffer,100mM Tris pH8.0,1.4M NaCl,20 mM EDTA pH8.0,2%CTAB,0.2%,巯基乙醇,酚,/,氯仿（,1:1,）,氯仿：,50 ml,无水乙醇,实验仪器,实验步骤：,取新鲜叶片约,3,g,剪碎,加入液氮充分研磨后转移至,2ml,离心管中；,2.,在,65,预热的提取液中按,3.8g/L,加入,Na Bisufite,混匀并调,pH,至,8.0,；,3.,在管中加入适量提取液，,60,水浴保温约,30,min,，不时颠倒混匀；,4.,冷却至室温后加入等体积氯仿,/,异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动,15min,左右；,5.,室温下,10000rpm,离心,1,5,min,，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，,-20,放置,1h,或过夜；,6.,挑出,DNA,置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量,70%,酒精，摇动洗涤,10min,，重复洗涤,2-3,次；,7.,吹干,DNA,，加入适量,TE,在,65,溶解，完全溶解后离心去除杂质；,加入,RNase,（,10mg/mL,）,室温处理,0.5-1h,除去,RNA,，,4,或,-20,贮存。,如需纯化,DNA,，再加入适量,TE,，氯仿,/,异戊醇多次抽提后吸取上清，加入,3ml/L NaAc,和两倍体积的乙醇，,-20,放置,1h,或过夜；,吹干沉淀后，加入适量,TE,，,65,溶解，,4,或,-20,贮存。,1.,植物叶子约,3,g,剪碎置,预冷,研钵中,加入液氮充分研磨，注意,不能干磨,混合球磨仪,3.60,水浴保温,30-60,min,加入等体积氯仿，用力摇匀,6.,再次,10000rpm,离心,5,min,；,将上清小心吸入新的离心管中；,DNA,样品在,1%Agarose,胶上电泳（例图）,实验注意事项,微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；,提取过程中的机械力可能使大分子,DNA,断裂成小片段，所以为保证,DNA,的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。,尽量取材幼嫩组织，最好在早晨取材，可以避免过多的糖分污染,