生物化学第24章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,24,章 生物氧化电子传递和氧化磷酸化作用,(Biological oxidation,electron transport and oxidative phosphorylation),一、氧化还原电势,二、电子传递和氧化呼吸链,三、氧化磷酸化作用,一、氧化还原电势,能斯特方程,两个电极组成电池的电动势,F:,法拉弟常数,96.5 kj/Vmol,反应物和产物浓度与电动势的关系式,对于一个氧化还原反应,a,Ar+bBo cAo+dBr,氧化还原反应的,判据,对于氧化还原反应来说，反应可以自发进行，是反应进行的限度。,如果已知两个氧还电对的标准电极电势，可以根据,G,0,=nFE,0,计算,出该反应的标准自由能变化值。,二、电子传递和氧化磷酸化,柠檬酸循环及其它降解代谢途径产生还原型辅酶，包括NADH和FADH,2,，将其携带的电子经过电子传递，最终交给分子O,2,，形成H,2,O。在电子传递过程中释放出大量的自由能，这些自由能被用来推动ATP的合成。,在,呼吸电子传递链中，总反应式为,NADH+H,+,+1/2 O,2,NAD,+,+H,2,O,G,0,=,220.07 kj/mol,FADH,2,+1/2 O,2,FAD+H,2,O,G,0,=181.58 kj/mol,线粒体结构图,柠檬酸循环在线粒体基质中进行，电子传递和氧化磷酸化在线粒体内膜上进行。,电子传递形成跨膜的质子梯度,在电子传递过程中，还,伴随有H,+,从线粒体内膜的基质侧，向内膜的外侧运输，结果造成跨线粒体内膜的质子梯度，这样在膜内外既造成质子的浓度梯度，又造成电势梯度，这种电化学势梯度贮存有能量，当质子由膜的外侧向内侧运动时，推动ATP合成。,电子传递链,呼吸电子传递链主要由蛋白质复合体组成，在线粒体内膜上有4种参与电子传递的蛋白质复合体，分别为,NADHQ还原酶（NADH-Q reductase）,琥珀酸Q还原酶（succinate-Q reductase）,细胞色素还原酶（cytochrome reductase）,细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase）,电子传递链标准氧还电势、自由能变化和,ATP,形成部位示意图,上半图,下半图,Protein Complexes of the,Mitochondrial Electron-Transport Chain,Complex,Mass,(kD),Sub-units,Prosthetic,Group,Binding Site for:,NADH-UQ reductase,850,30,FMN,Fe-S,NADH(matrix side),UQ(lipid core),Succinate-UQ reductase,140,4,FAD,Fe-S,Succinate(matrix side),UQ(lipid core),UQ-Cyt c,reductase,248,11,Heme b,L,Heme b,H,Heme c,1,Fe-S,Cyt c(intermembrane space side),Cytochrome c oxidase,162,10,Heme a,Heme a,3,Cu,A,Cu,B,Cyt c(intermembrane space side),电子传递链各个成员,1.,NADHQ还原酶,NADHQ还原酶又称为NADH脱氢酶，简称为复合体。该酶含有FMN辅基和Fe-S聚簇，催化反应时，先将NADH的电子传递到FMN上，再传给Fe-S聚簇，最后传给辅酶Q。Fe-S聚簇有几种类型，含有Fe-S聚簇的蛋白质称为铁硫蛋白，又称为非血红素铁蛋白。,Fe-S聚簇通过其中的Fe,2+,和Fe,3+,的变化来传递电子。,三种类型的,Fe-S,cluster,Fe Fe,2,-S,2,Fe,4,-S,4,半胱氨酸的巯基硫,NADH-Q,还原酶催化的电子传递,每传递,2个电子，可驱动4个H,+,从膜内侧运到膜外侧,。,电子传递链各个成员,2.,辅酶Q,辅酶,Q（Coenzyme Q）,又称泛醌（,ubiquinone,），有时简称为,Q,或,UQ,，是一种脂溶性物质，它可以接受,1,个电子还原成半醌中间体，再接受,1,个电子还原成对苯二酚形式。由于其脂溶性强，可以在线粒体内膜中扩散。它有一个长长的碳氢侧链，哺乳动物中最常见的是具有,10,个异戊二烯单位的侧链，简写为,Q,10,，在非哺乳动物中这个侧链可能只有,68,个异戊二烯单位。,辅酶Q的结构和氧化还原态,辅酶,Q,的,space-filling,模型,电子传递链各个成员,3.,琥珀酸Q还原酶,琥珀酸,Q,还原酶又称为复合体，完整的此酶包括柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，琥珀酸氧化为延胡索酸时脱下的氢还原了,FAD,，,FADH,2,将电子传递给琥珀酸,Q,还原酶的,Fe-S,聚簇，再传递给辅酶,Q,。,琥珀酸,Q,还原酶催化的电子传递,电子传递链各个成员,4.细胞色素还原酶,细胞色素还原酶又称复合体、辅酶Q细胞色素c还原酶。它的作用是将还原型辅酶,Q,的电子传递给细胞色素,c,。细胞色素还原酶中含有细胞色素b，也含有,2Fe-2S,聚簇。,细胞色素,（cytochrome),细胞色素是一类含有血红素辅基的电子传递蛋白质的总称。还原型细胞色素具有明显的可见光吸收，可以看到、和三个吸收峰，其中峰的波长随细胞色素种类的不同而各有特异的变化，可用来区分不同的细胞色素。氧化型细胞色素在可见光区看不到吸收峰。细胞色素中的血红素有三种，分别称为细胞色素,a,、,b,和,c,，同一种细胞色素血红素因结合的蛋白质不同，其吸收峰的波长会发生小的变化，如细胞色素还原酶中含有的细胞色素,b,就分为,b,H,（,b,562,）和,b,L,（,b,566,）两种。,B,型和,C,型血红素的结构,b型血红素 c型血红素,还原型细胞色素c的光吸收峰,几种细胞色素的最大吸收峰,波长/nm,细胞色素,a,600,439,b,L,566,b,H,562,532,429,c,550,521,415,c,1,554,524,418,细胞色素还原酶催化的电子传递,前半个,Q,循环，运出去2个质子。,细胞色素还原酶催化的电子传递,后半个,Q,循环，运出去2个质子。,电子传递链各个成员,细胞色素,c,是一个分子量,13000,的单链球形蛋白质，直径,3.4nm,，由,104,个氨基酸残基组成，含有一个血红素辅基。它是唯一能溶于水的细胞色素，并且是了解最为透彻的蛋白质之一。,5.细胞色素c,细胞色素,c,的三维结构,电子传递链各个成员,细胞色素氧化酶又称为复合体、细胞色素,c,氧化酶。它的作用是将还原型细胞色素,c,的电子传递给分子,O,2,，生成,H,2,O,。,6.细胞色素氧化酶,细胞色素氧化酶的传递电子作用,每传递2个电子可以运出2个质子。,氧与,a,3,及,Cu,B,结合的关系示意图,电子传递给氧生成水,电子传递的抑制效应,电子传递链中的抑制剂,三、氧化磷酸化作用,伴随着电子传递，ADP与Pi合成ATP的过程称为氧化磷酸化作用（oxidative phosphorylation）。相应地，我们将在代谢途径中由含磷酸的底物直接把磷酸基团转到ADP上形成ATP，称为底物水平磷酸化。,P/O,比,用组织匀浆以及组织切片做的实验表明，组织利用,O,2,的同时，,ATP,含量随之增加，每消耗,1,个,O,原子约合成,3,个,ATP,分子。这个比例称为,P/O,比。,P/O,比又可以看作是一对电子通过呼吸电子传递链传至,O,2,所产生的,ATP,分子数。根据,P/O,比为,3,，人们认为在电子传递链中，,ATP,是在,3,个不连续的部位生成的，根据电子传递链中各环节释放的能量，也确实有,3,个部位释放的能量大于合成,ATP,所需的能量。,FADH,2,进入电子传递链后的,P/O,比为,2,，说明它绕过了,1,个生成,ATP,的部位。,ATP,的合成部位,线粒体内膜上有许多球形突起，称为内膜球体（,inner membrane sphere,）。这些球体通过一个柄连接到内膜中的基座上，我们把球体和柄合称为,F,1,，基座称为,Fo,，,F,1,和,Fo,合称复合体。在离体条件下，这种复合体有水解,ATP,的活性，所以开始称它为,ATP,酶，后来发现在完整的线粒体中它的功能是合成,ATP,，现在称它为,ATP,合酶。,亚线粒体的电镜照片,ATP,合酶简图,ATP,合酶重组实验,能量偶联假说,（,1,）化学偶联假说,化学偶联假说是,1953,年,Edward Slater,最先提出来的。他认为电子传递过程中产生一种活泼的高能共价中间物，它随后的裂解驱动合成,ATP,，就像底物水平磷酸化那样。但是在氧化磷酸化中一直没有找到任何一种活泼的高能中间产物。,能量偶联假说,（,2,）构象偶联假说,这一假说是,1964,年,Paul Boyer,最先提出来的。他认为电子沿电子传递链传递使线粒体内膜蛋白质发生了构象变化，形成一种高能态。通过合成,ATP,使蛋白质恢复到原来的构象。这一假说至今也未能找到有力的实验证据。但是在,ATP,的合成过程中仍可能包含有不同形式的构象偶联现象。,能量偶联假说,（,3,）化学渗透假说,这一假说是,1961,年由英国生物化学家,Peter Mithell,最先提出的。他认为电子传递释放出的自由能及,ATP,合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。也就是说，电子传递释放的自由能驱动,H,+,从线粒体基质跨过内膜进入到膜间隙，从而形成跨线粒体内膜的,H,+,电化学梯度。这个梯度的电化学势驱动,ATP,合成。,化学渗透假说的原理图,化学渗透假说的实验证据,氧化磷酸化作用需要封闭的线粒体内膜存在。,线粒体内膜对,H,+,、,OH,、,K,+,、,Cl,等离子都是不通透的。,破坏,H+,浓度梯度的形成都必将破坏氧化磷酸化作用的进行。,线粒体内膜上的电子传递能够将,H,+,从基质运输到膜间隙。,人造的脂质小泡上重组细菌紫膜质和,F,1,Fo ATP,合酶后，在照光时有,ATP,的合成。,质子梯度驱动合成,ATP,的实验证明,细菌紫膜质,脂质小泡,线粒体F,1,F,o,ATP合酶,Peter Mitchell,Peter Mitchell因提出了化学渗透假说而获得了1978年的诺贝尔化学奖。,质子泵出是需能过程,一个质子逆电化学梯度跨过线粒体内膜的自由能变化可以用下式表示,G=2.3RT pH(,膜内,),pH(,膜外,),ZF,式中，是膜电势，即膜内外的电势差。,=(,膜外,)(,膜内,),质子转移的两种假设机制,（,1,）氧化还原回路机制,该机制由,Mitchell,提出。他认为电子传递链中有一些电子传递体既可以传递电子，也可以结合,H,+,，当它们被还原时，在膜内侧结合,H+,，而被氧化时，在膜外侧释放,H,+,，这样就把,H,+,从膜内运到了膜外。,氧还回路机制示意图,质子转移的两种假设机制,（2）质子泵机制,这个机制的内容是，电子传递导致复合体构象的变化，氨基酸残基在膜内侧结合,H,+,，构象变化后在膜外侧释放,H,+,，从而把,H,+,从膜内侧运到膜外。,合成,ATP,与跨膜质子的数量关系,在生理条件下合成,1,个,ATP,所需的自由能大约为,40,50kj/mol,。至少需要两个质子跨膜回流释放的能量才够合成,1,个,ATP,。因为转移出膜外的质子有一部分漏回膜内，测定的结果表明，每合成,1,个,ATP,需要泵出,2,3,个质子。,电子传递与质子泵出相偶联,线粒体跨内膜的质子梯度,F,1,和,F,o,的亚基组成,F,1,由5种肽链组成，,3,3,。Fo由3种疏水亚基组成，a,1,b,2,c,9-12,。Fo形成跨膜的管道，质子通过此管道流回到膜内侧时驱动ATP合成。F,1,的、和亚基分别由510、482、272、146和50个氨基酸残基组成，F,1,的总分子量为371kD。、亚基是同源的，每一个亚基结合有1个ATP，催化位点在亚基上，亚基上ATP结合位点的功能还不清楚，因为缺失这个位点并不影响F,1,的活性。,ATP,合成与蛋白质构象变化,John Walker,及其同事测定了,F,1,的结构，,F,1,ATP,合酶是一个不对称的结构，,3,个亚基有,3,种不同的构象。,Walker,研究发现，一个亚基,ATP,结合位点结合有,AMP-PNP,（一种不能被水解的,ATP,类似物），另一个结合有,ADP,，第三个位点是空的。这个发现与,Paul Boyer,提出的关于,ATP,合成的结合变化机制（,binding change mechanism,）相符，结合变化机制认为，,3,个反应位点协调地依次通过,ATP,合成的,3,种中间状态进行循环。,3,3,的不对称结构,侧面观 顶面观,分子马达,Fo,的,c,亚基排列成环，,c,亚基的构象是一对反平行的跨膜螺旋，在胞质溶胶侧由一个短的发卡环连接。,c,亚基环形成一个转子（,rotor,），相对于,a,亚基旋转，,a,亚基作为定子（,stater,），,a,亚基由,5,个跨膜的螺旋组成，在膜的每一侧有质子流动的通道（,proton access channels,）。亚基将,F1,和,Fo,连接起来，在,ATP,合成时亚基也相对于,(,),3,复合体旋转。如果亚基固着在,c,亚基转子上，它们就可以一起转动。,b,亚基有,1,个跨膜片段和,1,个长的亲水头部，完整的定子由,b,亚基固着在,a,亚基的一端，并通过亚基与,(,),3,结合在一起。,ATP,合酶的结构和工作原理,Rotation of the,g,subunit and the,ring of,c,subunits,in the F,o,F,1,complex,was observed by,in vitro,studies,using fluorescence,Microscopy(K.,Kinosita,1997),Fluorescencetly,labeled,The worlds smallest,molecular motor:,rotational catalysis.,Rotation of the,g,subunit and the ring of c subunits in in the,F,o,F,1,complex as directly observed by,in vitro,studies using,fluorescence microscopy:they rotate in 120-degree,increments,with each step consume one ATP;operation,efficiency near 100%.,质子从膜外侧返回内侧的通道,c,转子每一个亚基上有一个重要的残基,Asp61，,将这个,Asp,突变成,Asn,将失去,ATP,合酶活性。,c,转子相对于定子的旋转可能依赖于,Asp61,上负电荷的中和。质子从,a,亚基的胞质溶胶侧的通道进入，质子化,Asp61,，推动转子旋转，直到到达,a,亚基的基质侧质子通道，,Asp61,上的质子再解离通过此通道进入膜内侧。这样的旋转能够引起亚基相对于,(,),3,复合体旋转，导致,3,个亚基依次发生构象变化。,Model of the,E.coli,ATP synthase:,the proton gradient drives the,rotation of the,c,ring,using two half-channels,on the,a,subunit.,(,3ATP made per 10-14,protons transported:,3H,+,/ATP,.),ATP,合酶的亚基构象循环变化与,ATP,合成,ADP+Pi,ADP+Pi,Energy,Paul Boyer,和,John Walker,因上述发现共享了,1997,年的诺贝尔化学奖。,F,1,F,o,ATP,合酶的抑制剂,在,ATP,合酶的柄部有一种寡霉素敏感性授予蛋白（,oligomycin-sensitivity-conferring protein,，,OSCP,），这种蛋白使复合体对寡霉素敏感，使得寡霉素抑制,ATP,的合成。,Fo,的名称即来自于此。,二环己基碳二亚胺（,dicyclohexylcarbodi-imide,，,DCCD,）能够修饰,Fo,蛋白中某亚基的,Glu,残基，导致抑制质子通过,Fo,，这种能被,DCCD,修饰的蛋白又称为,DCCD,结合蛋白。,氧化磷酸化的解偶联和抑制,1,解偶联剂（,uncouplers,）,解偶联剂的作用是将膜外侧的质子运到膜内侧，破坏质子梯度，导致不能合成,ATP,，但不影响电子传递。,氧化磷酸化的解偶联和抑制,2,氧化磷酸化抑制剂（,inhibitors,）,这类试剂的作用是既抑制,ATP,的合成，又抑制氧的利用，但不直接抑制电子传递链上的电子传递体。寡霉素就是属于这类抑制剂,它,阻止H,+,通过F,o,。,寡霉素对线粒体氧消耗的抑制作用,氧化磷酸化的解偶联和抑制,3,离子载体（,ionophores,）,这是一类脂溶性物质，如缬氨霉素，它们能与除,H,+,外的其它一价阳离子结合，从膜外侧运到膜内侧，破坏由质子梯度造成的电势梯度，从而抑制,ATP,的合成。,细胞溶胶内,NADH,的再氧化,甘油-3-磷酸穿梭途径,细胞溶胶内,NADH,的再氧化,苹果酸-天冬氨酸穿梭途径,氧化磷酸化的调控,电子传递受可用底物量和,ADP,量的调控。既无可氧化的底物又无,ADP,时为状态，加入,ADP,后为状态（无可用的底物），加入底物后为状态，,ADP,用完后为状态，再加入,ADP,后为状态，氧耗尽后为状态。状态的耗氧速率与状态的耗氧速率之比为呼吸控制的定量表示法。,线粒体呼吸的几种状态,呼吸控制值的意义,完整的线粒体其呼吸控制值可高达,10,以上，而受损伤或衰老的线粒体此比值可低至,1,，这表明电子传递已与,ATP,的合成失去了偶联，虽然电子传递仍保持最大速度，但失去了磷酸化作用。,1分子葡萄糖彻底氧化产生的,ATP,数,当细胞溶胶中的NADH通过甘油-3-磷酸穿梭途径进入电子传递链时，为30个ATP；,当细胞溶胶中的NADH通过苹果酸天冬氨酸穿梭途径进入电子传递链时，为32个ATP。,详见P142表24-5,