第六章-氨基酸与核酸发酵.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 氨基酸与核酸发酵,第一节 谷氨酸生产 第二节 其他氨基酸发酵,一、氨基酸概论,1,、氨基酸简介,构成蛋白质的基本分子单元。,碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。,目前世界上可用发酵法生产氨基酸有,20,多种。,二、氨基酸的用途,（,1,）食品工业：,强化食品,：,赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中,增鲜剂：,谷氨酸单钠和天冬氨酸,苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂,(-,天冬酰苯丙氨酸甲酯,),此产品,1981,年获,FDA,批准,现在每年产量已达数万吨。,（,2,）饲料工业：,甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料，添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。,（,3,）医药工业：,多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调,氨基酸注射液由,1985,年的,100,万瓶增长到,2003,的,1.5,万瓶，每年以,15-20%,的速度递增，全行业的年产值预计能达到,10,亿元,苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。,（,4,）化学工业：,能保持皮肤湿润的润肤剂,焦谷氨酸钠和质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料。,表,3-8,世界氨基酸主要生产厂家生产能力,品名,厂家,生产能力,品名,厂家,生产能力,蛋氨酸,日本曹达,20000,谷氨酸,味之素,60000,蛋氨酸,日本住友化学,5000,谷氨酸,日本旭化成,15000,蛋氨酸,日本化药,2500,谷氨酸,协和发酵,15000,蛋氨酸,德国迪高沙,85000,谷氨酸,日本武田药品,15000,蛋氨酸,法国,AEC,105000,色氨酸,味之素,100,蛋氨酸,美国孟山都,45000,色氨酸,昭和电工,200,蛋氨酸,墨西哥阿尔拜梅克斯,5000,色氨酸,三井东压,100,蛋氨酸,西班牙,Sodeti,4000,色氨酸,田造制药,50,蛋氨酸,苏联,Volgograd,4000,色氨酸,日本化药,50,色氨酸,协和发酵,50,赖氨酸,日本味之素,55000,甘氨酸,日本有机合成化学,6000,赖氨酸,日本协和发酵,20500,甘氨酸,协和发酵,5000,赖氨酸,日本东丽,6500,甘氨酸,日本化药,1000,赖氨酸,南朝鲜味元,10000,丙氨酸,武藏野化学研究所,丙氨酸,日本化药,三、氨基酸的生产方法,发酵法：,直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵。,添加前体发酵法：,如用邻氨基苯甲酸，生产,L-,色氨酸；甘氨酸生产,L-,丝氨酸。,酶法：,利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产,L-,天冬氨酸。,提取法,：常用毛发、血粉等蛋白质原料水解，从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸,合成法：,合成法获得,DL-,蛋氨酸、不对称合成法获得,L-,氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。,传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。,糖蜜的预处理,目的,：,降低生物素的含量，因为含有过量的生物素会影响谷氨酸的积累。,处理方法：,1.,活性炭处理,2.,水解活性炭处理,3.,树脂处理,淀粉的处理,谷氨酸生产菌都,不能直接利用淀粉,，所以必须将淀粉原料水解成葡萄糖后才能利用。,淀粉糖化后得到淀粉水解糖，主要是葡萄糖但是根据水解条件不同，还有少量的麦芽糖、二糖、低聚糖，葡萄糖是谷氨酸菌的营养物，所以淀粉水解液的质量是发酵产高酸的重要环节。,水解方法,：酸解法；酶解法；酸酶结合法,酸解法,利用无机酸为催化剂，在高温高压将淀粉转化为葡萄糖。,优点：,工艺简单、水解时间短、效率高、设备周转快,缺点：,要求有耐高温、耐高压设备，副产物也多影响糖的纯度。,糖化过程：,酸作用于淀粉能生成糖，其中间物质有糊精、低聚糖、麦芽糖最后生成,葡萄糖,。,工艺流程,决定水解速度的因素,：,淀粉乳的浓度；酸的种类和用量；水解的温度和压力。,1.,淀粉乳的选择,：,淀粉乳浓度低有利于水解。,2.,催化作用是氢离子的催化作用,：,盐酸和硫酸，国内盐酸为主,pH1.5,左右,3.,温度和压力对应,：,0.25-0.4mpa,，时间,20,分钟,中和：,淀粉水解葡萄糖后，作为催化剂的,HCl,必须除去。调节,pH,值,4.5-5.0,。,脱色,：水解液中有杂质，不利于发酵也不利于提取一般要进行脱色处理，活性碳吸附法,过滤除杂：,温度高易过滤但胶体物质沉淀不完全；低温过滤，糖液粘度大过滤困难。一般,60-70,。,酶解法,先用淀粉酶将淀粉水解成糊精和低聚糖，然后再用糖化酶将糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖。,优点：,条件温和、酶的专一性强、很少发生副产物,色泽浅，质量高。,缺点：,时间较长、对温度和,pH,的变化比较敏感、酶活力随时间延长而下降，酶活力相差较大、设备较多,酶解法工艺条件,1.,淀粉的液化：淀粉在淀粉酶的作用下分子断裂生成糊精及低聚糖粘度下降流动性增强,液化条件,：,淀粉乳糊化,是酶法制备淀粉糖的第一个必须步骤；,采用较高温度,88-90,；,pH,值,6.0-7.0,酶较稳定；,淀粉的浓度控制在,30%-35%,；,酶活力稳定性与钙离子浓度有关，一般加氯化钙和硫酸钙调节钙离子浓度，一般,0.01mol/L,。,糖化：,糖化酶将淀粉的液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。,糖化酶的来源,:,主要来自曲霉、根霉、拟内孢霉等,糖化工艺条件：,不同来源的葡萄糖淀粉酶对糖化时温度和,pH,方面的要求存在差别。一般选择较高温度糖化，这样速度快。葡萄糖的复合反应发生程度与酶的浓度及底物浓度有关。,糖化操作,开口的装有搅拌和保温装置的糖化桶进行，糖化酶100单位/g干淀粉，pH值4.5左右，开始搅拌15min，后静置保温50-60摄氏度，糖化时间24h左右。为了缩短时间可中途补加糖化酶，糖化结束升温至100，保持5min，以灭酶。,二、谷氨酸产生菌,谷氨酸棒杆菌,(,Corynebacterium ghotamlkns,),黄色短杆菌,(,Brevibacterium flavum,),乳糖发酵短杆菌,(,Bra.lactofementum,),嗜氨小杆菌,(,Microbaterium ammoniaphilmn,),硫殖短杆菌,(,Brevithiogenitalis,),。,我国各味精厂使用的谷氨酸生产菌大部分是从自然界土壤中分离得到的野生型菌株通过诱变筛选的,谷氨酸棒杆菌,。,大部分以,AS-1299,为出发菌株经紫外线、硫酸二乙酯等复合诱变得到高产或耐高糖的菌株。,菌种,形态,G,属性,呼吸类型,碳源基质,棒状杆菌属,直或微弯，一端膨大。折断分裂呈八字排列，不运动,G,好氧或厌氧,葡萄糖发酵产酸，少数利用乳糖产酸,短杆菌属,短的不分支直杆菌，多数不运动，少数运动有鞭毛。,G,好氧,葡萄糖发酵产酸,小杆菌属,杆状，形态与排列与棒状杆菌相似,G,好氧,发酵糖产酸弱，主要产乳酸，不产气,节杆菌属,培养过程细胞形态易变化，先由球菌变杆菌，随后由杆菌变球菌，不运动,G,变,G,，后由,G,变,G,好氧,发酵糖产酸极少或不产酸。,表,1,谷氨酸发酵微生物特征及菌学比较,谷氨酸合成途径,氨基酸合成的方式,1.,氨基转移作用,：,转氨酶,催化的转氨反应,-,酮戊二酸和其它氨基酸经过转氨酶的作用下使,-,酮戊二酸,转化成谷氨酸。,2.,还原氨基化作用,：,NH4+,供氢体辅酶,的存在下,-,酮戊二酸,在,谷氨酸脱氢酶,的催化下生成谷氨酸。,3.,谷氨酸合成酶催化反应,：,-,酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,AT,谷氨酸,草酰乙酸或丙酮酸,+,-,酮戊二酸,+,谷氨酸钠,NADPH,+,2,谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,GS,-,酮戊二酸,NH,4,+,NADPH,谷氨酸,H,2,O,NADP,+,谷氨酸脱氢酶,GHD,+,+,+,谷氨酸的生物合成途径,异柠檬酸,裂解酶,-,酮戊二酸脱氢酶,1,、谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径）,（,1,）糖酵解途径（,EMP,）,（,2,）磷酸已糖途径（,HMP),（,3,）三羧酸循环,(TCA,环,),（,4,）乙醛酸循环（,DCA,环）,（,5,）二氧化碳固定反应,PEP+CO,2,+GTP,草酰乙酸,+GDP,丙酮酸,+CO,2,+NADH,苹果酸,+NAD,草酰乙酸,CO,2,NAD+NADH+H,+,（,6,）,-KGA,的还原氨基化反应,PEP,羧化酶,苹果酸酶,苹果酸脱氢酶,在,GA,产生菌菌体内,CO2,固定反应有以下两条途径,：,苹果酸酶,丙酮酸羧化酶,磷酸烯醇丙酮,酸羧化酶,CO2,固定反应,(,丙酮酸羧化支路,),2,、,GA,生物合成的理想途径具备的条件,（,1,）,GA,产生菌应具备以下条件（内在因素,）,-,酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失,TCA,环阻断，,-,酮戊二酸积累,琥珀酸辅酶,A,TCA,环正常,GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失,积累,NADPH,，抑制,KGA,的脱羧氧化,GA,产生菌体内,必须有,乙醛酸循环（,DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶,通过该酶酶活性调节实现,DCA,循环的封闭，,GA,发酵积累,菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性,KGA+NH,4,+,+NADPH=GA+NADP,提供,NADPH,用于还原,-,酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系,该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联,生物素,供氧浓度,NH,4,+,浓度,（,2,）影响谷氨酸合成的外在因素,a,、生物素对糖代谢的影响,生物素参与糖代谢作用：,增加糖降解的速度,乳酸积累,碳源利用率降低，发酵液的,pH,值下降。,而丙酮酸氧化脱羧的速度提高不大,丙酮酸积累,A,、生物素对,GA,发酵的影响,主要影响糖降解速度，不影响,EMP,与,HMP,途径的比率。生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，引起乳酸的溢出。,控制生物素？,研究表明，异柠檬酸裂解酶活性,为醋酸诱导,受琥珀酸的阻遏，抑制,当,V,H,缺乏时：,（,1,）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，则：乙酰辅酶,A,的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性,（,2,）,V,H,对,TCA,循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸,-,酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动,两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，,DCA,循环得到封闭。,b,、控制,V,H,的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭,c,、生物素对氮代谢的影响,V,H,丰富时，出现“,只长菌，不产酸,”的现象,GA,发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,防止,关于氮代谢的调节：,控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。,在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。,在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。,d,、,V,H,对菌体细胞膜通透性的影响,通常谷氨酸发酵采用的菌种都是,V,H,-,，而,V,H,又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制,V,H,的浓度（,干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）,来实现的来实现对菌体细胞膜通透性的调节。,葡萄糖,丙酮酸,+,丙酮酸,乙酰辅酶,A,乙酰辅酶,乙酰辅酶,A,羧化酶,（,辅酶是,V,H,）,CO2,丙二酰辅酶,A,丙二酰辅酶,A,C4,C6,CO2,培养基中生物素限量时，胞内,AA,92%,胞外,培养基中生物素丰富时，胞内,AA,12%,胞外,CO2,Glu,生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适,量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失,调使,Glu,得以积累。,生物素贫乏时，细胞内的,Glu,含量少而且容易析出，而培,养基中积累大量的,Glu,；生物素丰富时，培养基中几乎不,积累,Glu,，而细胞内却含有大量的,Glu,，且不易被析出。,这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养基中积累。,B,、供氧浓度,过量：,NADPH,的再氧化能力会加强，使,-KGA,的还原氨基化受到影响，不利于,GA,的生成。,供氧不足：,积累大量的乳酸，使发酵液的,pH,值下降，不利于,GA,的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,C,、,NH,4,+,浓度,（,1,）影响到发酵液的,pH,值,（,2,）与产物的形成有关：,过低，不利于,-KGA,的还原氨基化；过高，产生谷氨酰胺。,NH4+,的供给方式：,（,1,）液氨,（,2,）流加尿素,研究证明：,谷氨酸生产菌种存在,EMP,途径的全部酶和,HMP,途径有关,的酶,TCA,循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生,成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关,以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，,DCA,循环是,C,4,二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷,氨酸生成期此循环应关闭,谷氨酸菌存在,CO,2,固定生成草酰乙酸的,PEP,羧化酶和苹果,酸酶，与谷氨酸得率正相关,1.,切断或减弱支路代谢,2,.,解除自身的反馈抑制,3.,增加前体物的合成,4.,提高细胞膜的渗透性,5.,强化能量代谢,6.,利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株,谷氨酸生产菌的具体育种思路,（谷氨酸代谢控制发酵的基本方法和实现的途径）,1.,切断或减弱支路代谢,选育减弱,-,酮戊二酸进一步氧化能力的突变株,减弱,-,酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。,选育减弱,HMP,途径后段酶活性的突变株,从葡萄糖到丙酮酸的反应由,EMP,途径和,HMP,途径组成。但通过,HMP,也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、辅酶,Q,、维生素,K,、叶酸等物质。消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。如削弱或切断这些物质的合成途径，就会使谷氨酸的产率增加。可通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素，如德夸菌素、狭霉素,C,抗性突变株来实现。,选育不分解利用谷氨酸的突变株,（不分解）,积累谷氨酸，必须使菌种不能分解利用谷氨酸，可通过选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株来实现。,选育减弱乙醛酸循环的突变株,四碳二羧酸是由,CO2,固定反应和乙醛酸循环所提供的。减弱乙醛酸循环，,CO2,固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高。可通过选育琥珀酸敏感型突变株、不分解利用乙酸突变株、异柠檬酸裂解酶活力降低菌株实现。,阻止谷氨酸进一步代谢,（不代谢）,细胞还可以谷氨酸为前体继续向下合成谷氨酰胺等，必然导致谷氨酸的积累量减少。要避免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。,2.,解除菌体自身的反馈调节,选育耐高渗透压突变株,菌种高产谷氨酸,应,具备在高糖、高谷氨酸的培养基中能正常生长、代谢的能力，即在高渗培养基中菌体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影响很小。可通过选育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖,+,高谷氨酸突变株来实现。,选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株,谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨酸的合成。若解除了谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈调节，菌体就会不断的合成谷氨酸。可通过选育谷氨酸结构类似物抗性突变株来实现。,3.,增加前体物的合成,选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到,-,酮戊二酸代谢的突变株,这可通过选育柠檬酸合成酶活力强突变株来实现。,选育强化,CO,2,固定反应的突变株,这可通过选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好的突变株。,4.,提高细胞膜的渗透性,选育抗生物素缺陷突变株,选育溶菌酶敏感突变株,。,（,3,）,选育温度敏感突变株,经过诱变低温生长，高温不能生长繁殖,。,（,4,）油酸缺陷型（油酸亚适量）,（,5,）甘油缺陷型（甘油亚适量）,谷氨酸生产菌形态特征,细胞形态为球形、棒形以至短杆形。,革兰氏染色阳性，无芽孢、无鞭毛、不运动,都是需氧形微生物，在通气条件下才能产生谷氨酸。,都是生物素缺陷型，需要生物素作为生长因子,脲酶强阳性,不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶,发酵中菌体发生明显形态变化和细胞渗透性的变化,谷氨酸生产菌的生化特征,(1),有催化固定二氧化碳的二羧酸合成酶,苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的存在使三羧酸循环的中间代谢物能得到补充。同时，丙酮酸脱羧酶活力不能过强，以免丙酮酸被大量耗用而使草酰乙酸的生成受到影响。,(2),酮戊二酸脱氢酶的活性很弱，这样有利于,酮戊二酸的蓄积，当有,NH4+,存在时，在谷氨酸脱氢酶催化下，由,酮戊二酸不断生成谷氨酸。,(3),异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物,酮酮戊二酸的生成，满足合成谷氦酸的需要。由于,酮戊二酸脱氢酶的活性弱，琥珀酸的生成量少，在长菌期，菌体通过乙醛酸循环来弥补三羧酸循环中间代谢物的不足；但当细菌进入产酸期后由于固定二氧化碳的二羧酸合成酶的活力已增强，三羧酸循环的中间代谢物完全能够依靠二氧化碳固定反应得到补充，为了有利于谷氨酸的蓄积，此时异柠檬酸裂解酶的活力应降到最小。,(4),谷氨酸脱氢酶活力高，有利于谷氨酸的生成。,(5),谷氨酸脱氢菌催化,酮戊二酸还原氨基化反应时，需要有,NADPH2,作为供氢体。如果,NADPH2,过多地经呼吸链氧化，使所带的氢跟氧结合生成水，那么由于氢的不足，将影响谷氨酸的生成。所以，谷氨酸生产菌经呼吸链氧化,NADPH2,的能力要求弱。,(6),菌体本身进一步分解转化和利用谷氨酸的能力低下，也有利于谷氨酸的蓄积,.,(7),菌种是生物素营养缺陷型,有利于生成的谷氨酸分泌到胞外来。,谷氨酸发酵工艺,发酵培养基：碳源、氮源、生长因子和无机盐,1.,碳源,：构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源。,糖浓度：,对谷氨酸发酵有很大的影响。浓度过高由于渗透压增大对菌体生长和发酵不利，一般采取低浓度糖的流加糖发酵工艺。,125-150g/L,淀粉水解糖质量：,对谷氨酸发酵影响很大。如水解不完全有糊精存在会产生泡沫影响发酵的正常进行。,氮源：,是合成菌体蛋白质核酸等含氮物质和合成谷氨酸的氨基来源。,谷氨酸发酵需要的碳氮比一般的发酵工业低：,100,：,15-30,。碳氮比对谷氨酸发酵的影响很大。不同阶段要控制碳氮比以促进以生长为主阶段向产酸阶段转化。,不同的菌种要结合发酵特点合理的选择氮源，不同的氮源其添加方法也不同，作用快的采用流加为宜，也可以采用分批加入。,无机盐：,是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功能构成菌体成分；作为酶的组成；酶的激活剂；调节培养基的渗透压；调节,pH,和氧化还原电位。量很少但对菌体生长和代谢产物的生成影响很大。,磷量对谷氨酸发酵影响很大，过高是菌体代谢转向合成核酸，过低菌体代谢不好。,生长因子：,凡是微生物生长所不可缺少的而自身有不能合成的微量有机物质。如氨基酸、维生素等均称为生长因子。目前谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。,提供生长因子的农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜和酵母等。,培养基灭菌,种子的扩大培养：,1.,斜面菌种的培养,2.,一级种子培养,3.,二级种子培养,一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。,pH6.5-6.8,。,1000ml,三角瓶装量,200,250ml,，震荡，,32,，培养,12h,。,二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵灌投料体积的,1,，用水解糖代替葡萄糖，于,32,进行通气搅拌,7,10h,。,发酵条件控制,1.,温度对发酵的影响,谷氨酸产生菌的生长繁殖和谷氨酸的生成都是在不同酶的催化下进行的酶促反应，不同酶促反应所需要的最适温度也不同。,发酵前期,最适温度为,30-34,；,产谷氨酸,的最适温度,35-37,。,pH,对发酵的影响：,影响酶的活性使细胞的代谢受阻影响细胞膜的渗透型，微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄影响营养物质和中间代谢产物的离解。,前期,菌体生长需要大量的氮源,pH,7.5,中后期,大量谷氨酸合成期,pH,7.2,发酵后期,pH,7.0,pH,的变化是谷氨酸发酵的重要指标，国内普遍使用,尿素流加法,。,通风与搅拌,对发酵的影响：谷氨酸产生菌为兼性好气性微生物，供氧是否都可以生长然而产物有所不同。,菌体生长期供氧必须满足菌体呼吸的需氧量,谷氨酸生成期要求充分供氧,泡沫控制,：,通风和搅拌会产生少量泡沫是正常的，但泡沫过多会影响发酵的正常进行。,消泡方法：,物理机械和加入消泡剂,常用消泡剂有,：天然油脂类、高碳醇、脂肪酸、脂类、聚醚类硅酮类,谷氨酸发酵过程的主要变化规律,1.,适应期：,种子刚接入发酵罐菌体处于适应期细胞进行呼吸作用个体长大但没有分裂糖汁基本不耗,pH,上升是尿素分解放出氨所致，一般为,3h,左右。,2.,对数生长期：,适应期后开始繁殖，代谢旺盛菌体大量繁殖，耗糖速度加快，流加尿素补充氮源和调节,pH,值，温度上升耗氧量增大，提高通风量促进菌体转化此阶段为长菌阶段，极少产谷氨酸。一般,3-10h,3.,转化期：,生物素限量的情况下部分菌体停止繁殖，在条件适宜时开始伸长形成生产型细胞开始积累谷氨酸，时间,10-18h,，菌体达到最大值，这是代谢最旺盛阶段耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加,4.,产酸期：,菌体完成由增殖型想生产型转化大量积累谷氨酸产酸达到最大值，继续流加尿素保证有充足的氮源,pH7.0-7.2,温度,36-37,时间延长，糖耗尽，菌体活力降低耗氧量减少,pH6.8-7.0,，残糖,1%,。,谷氨酸的提取,一、概述,(,一,),谷氨酸发酵液的性质,在发酵液中，除含有谷氨酸外，还存在着菌体、残糖、色素、胶体物质及其他发酵副产物。谷氨酸发酵结束后，发酵液的温度在,34,36,，,pH6.0,7.5,，接近中性。整个发酵液外观呈浅黄色浆状，表面浮有少许泡沫。,正常谷氨酸发酵液的组分如下：,1.L-,型谷氨酸，一般以谷氨酸铵盐,(,C,5,H,8,O,4,N,NH,4,),形式存在。,2.,无机盐,(,K,+,、,Na,+,、,NH,+,、,Mg,2+,、,Ca,2+,、,SO,4,2-,等,),、残糖、色素、尿素以及消泡用的花生油、豆油或合成消泡剂等。,3.,大量菌体、蛋白质等固形物质悬浮在发酵液中，湿菌体约占发酵液的,2,5,。,4.,少量发酵副产物，如乳酸、,r,酮戊二酸和琥珀酸、天冬氨酸、,丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺等，,各种氨基酸的含量为,10,。,5,0.6,0.8,的铵离子、,1,的残糖。,6,核苷酸类物质及其降解产物，如发酵液中含腺嘌呤,0.02,0.05,，尿嘧啶约占发酵液的,0.01,0.03,。,(,二,),谷氨酸的提取方法,分离提纯原理,：,利用它的两性电解质性质、谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等。,提取方法：,等电点法、离子交换法、锌盐法等。为了提高提取收,率，还可采用等电点,锌盐法，等电点,离子交换提取工艺,提取新技术：,电渗析和反渗透法、浓缩等电点法、离子硅藻土过滤等电点法等。,二、等电点结晶法提取谷氨酸,此法操作简便、设备简单，但操作时间长，占地面积多。,(,一,),等电点法提取谷氨酸的原理,谷氨酸分子中含有两个酸性羧基和一个碱性氨基，其解离方式,取决于溶液的,pH,，在不同,pH,的溶液中，以,阳离子、两性离子和阴离子,等几种不同的离子状态存在。,当,pH,3,22,，,-,羧基的解离受到抑制，谷氨酸主要以阳离子形式存在，带正电荷；,当,pH,3,22,时，谷氨酸主要以两种不同的阴离子形式存在，带负电荷；,当,pH,3,22,时，谷氨酸呈电中性，绝大部分以偶极离子存在，其分子内部正负电荷相等，溶液中的总静电荷等于零。,1.,谷氨酸结晶的性质,谷氨酸结晶属斜方晶系离子晶体，具有多晶型性质。在不同的条件下，可以得到,-,型谷氨酸结晶和,-,型谷氨酸结晶。,-,型结晶的晶轴长短接近，晶体粗壮，呈颗粒状，且颗粒大，质量高，易沉淀分离，是一种理想的结晶。,-,型谷氨酸结晶晶轴长短不一，呈针状或鳞片状，晶粒微细、纯度低、质量轻、不易沉淀析出。因此，在操作中要控制结晶条件，以利于形成,-,型结晶。,2.,影响晶型的因素,影响谷氨酸晶体晶型的因素有发酵液中,谷氨酸的含量、结晶析出温度、残糖浓度等。在室温自然冷却条,件下，随谷氨酸含量的升高，,-,型谷氨酸结晶增多，水分增多，,分离困难。,当结晶析出的温度超过,30,时，,-,型谷氨酸结晶增加。因此，,在采用等电点法提取谷氨酸时，必须把发酵液温度降到,30,以下，,避免形成,-,型结晶。发酵液中残糖浓度高，,-,型结晶增加，残,糖越低，则有利于形成,-,型结晶。,3.,影响谷氨酸结晶析出的主要因素,谷氨酸含量,。,用等电点法提取谷氨酸时，要求谷氨酸含量在,4,以上，否则，可先浓缩或加晶种后，再用等电点法提取谷氨酸。若谷氨酸含量大于,8,，易形成,-,型结晶。,温度及降温速度。,谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，,使谷氨酸从发酵液中结晶析出。为了有利于形成,-,型结晶，结,晶温度要低于,30,。且降温要缓慢，以形成较大的结晶颗粒。,投晶种与育晶。,在晶核形成以前，适时投放一定量的晶种，有利于收率的提高。生产上根据发酵液中谷氨酸的含量和,pH,来确定投种时间，一般谷氨酸含量在,5,左右、,pH4.0,4.5,时投晶种；谷氨酸含量在,3.5,4,.0,、,pH,为,3.5,4.0,时投晶种。投种量一般为发酵液的,0.2,0.3,。,加酸。,加酸的主要目的是调节发酵液的,pH,，使其达到谷氨酸的等电点。加酸速度的快慢对晶体的大小影响很大。在生产上，一般要求前期加酸稍快，中期,(,晶核形成前,),加酸要缓，后期加酸要慢，使,pH,缓慢降到等电点为止。,搅拌,。,适当搅拌有利于晶体长大，使菌体大小均匀一致。搅,拌还可以减少结晶粒子的互相黏接，避免晶簇的形成。搅拌转速,与设备直径和搅拌浆叶大小有关，一般以,20,30r,min,为宜。,(,二,),等电点提取工艺的操作要点,1.,加酸调等电点,将发酵液排入等电桶后，测量温度、,pH,和谷氨酸含量，然后搅拌冷却，待液温降至,30C,时，加盐酸调,pH,。,前期加酸稍快，,1h,左右将发酵液的,pH,调至,5.0,。中期加酸要缓慢，,约经,2h,，发酵液的,pH,接近,4.0-4.5,时，观察晶核形成情况。当,菌体。,发酵液中残存菌体的大小及多少，因菌种的不同而异。,AS.l.542,菌的菌体大，数量少，质量轻，相对地说，容易同谷氨酸结晶分离。,发酵液若染噬菌体，色泽深灰甚至发红，黏度增大，泡沫多谷氨酸的纯度和收率较低。,能目视发现晶核时，要停止加酸，育晶,1,2h,，使晶核壮大。此后加酸速度要慢，直到,pH,为,3.0-3.2,时，停止加酸，继续搅拌,20h,结束。整个中和温度要缓慢下降，不能回升。,最终温度越低越好。,2.,沉降分离,将中和好的发酵液静置沉淀,4,6h,，放出上清液，然后将谷氨酸结晶沉淀层表面的少量菌体细麸酸清除，放另一缸中回收利用，底部的谷氨酸结晶取出后，离心分离。,自从,1956,年日本首次利用微生物发酵法生产谷氨酸成功后，促进了其他氨基酸的开发，目前可以用发酵法生产的氨基酸已有,20,多 种，其中赖氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸等已工业化生产。大量的谷氨酸、赖氨酸以很低廉的价格供应市场。,第二节 其他氨基酸发酵,一、赖氨酸发酵,首先是出发菌株的选择。,不同微生物的赖氨酸生物合成的调节机制是不同的。从高产赖氨酸菌种获得易难来看，应选择代谢调节机制比较简单的细菌作为出发菌株，如,黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌,等。,出发菌株确定后，根据菌株特性，经诱变来选育赖氨酸产生菌。,至今为止，所用的赖氨酸生产菌多数为谷氨酸产生菌的变异株，其赖氨酸合成途径都是经过,DAP,(,二氨基庚二酸,),途径，在此途径中关键酶,天冬氨酸激酶,受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制,微生物代谢调控,改变遗传特性,谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸,利用诱变育,种等方法，,选育不能合,成高丝氨酸,脱氢酶的菌,种用于生产,.,我国近几年来在赖氨酸育种上取得了一些可喜成绩。,刘汉森等以赖氨酸产生菌,37102,为出发菌株，经,NTG(,亚硝基胍,),诱变处理得到一突变株,M1083,。摇瓶产酸率平均为,5,35,一,6.39,，最高可达,7.5,；复旦大学生物系以谷氨酸高产菌株,FM84-415,为出发菌株经诱变得突变株,FML8412,，摇瓶产赖氨酸,6.43,，对糖转化率为,44.9,。,目前，我国科研工作者已把生物技术应用于赖氨酸发酵的研究,L,天门冬氨酸是生产,甜味肽,(aspartame),的主要原料。它的生产方法有,直接发酵法、酶法和固定化细胞连续生产法,三种。,生化特征：,天冬氨酸激酶活活力,丧失；谷氨酸脱氢酶活力丧失；丙酮酸氨化酶活力微弱或丧失；二氧化碳固定化能力强；柠檬酸合成能力弱，草酰乙酸氨基化能力强。,二,L-,天冬氨酸族氨基酸,(,一,),发酵法生产,1982,年，,Shiilo,等利用黄色短杆菌的柠檬酸合成酶缺损变异株，在含,3.6,葡萄糖的营养培养基中，,30,振荡培养,48h,，获得,10.6g,L,的天门冬氨酸。,(,二,),酶法及固定化细胞连续生产法,大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、,-,氨基,正酪酸耐性的短杆菌等，均含有天冬氨酸酶，可由延胡索酸生产天门冬氨酸。,酶法由延胡索酸生产,L-,天门冬氨酸本是采用大肠杆菌，但其细胞壁较脆弱，必须将菌体固定化。据日本三菱石油化学公司报道，黄色短杆菌因其具有坚硬的细胞壁，可以不用固定化方法，而改用菌体再循环法，由延胡索酸生产,L-,天门冬氨酸，节约了菌体固定化所需的费用，减低了,L-,天门冬氨酸的生产成本，估计年产量为,1000t,。,三、苏氨酸发酵,苏氨酸也是一种必需氨基酸，它最早是从血纤维蛋白,分离到的，它的生产长期以来一直依赖于动植物蛋白质的水解提取，直到近一二十年才逐渐用发酵法进行生产。,苏氨酸发酵不仅要解除终产物对关键酶天冬氨酸激酶的反馈调节，还需要解除终产物对关键酶,高丝氨酸脱氢酶,的反馈调节。,无锡轻工学院以乳糖发酵短杆菌,X05121,为出发菌株,(,原系谷氨酸生产菌,),经诱变，获得,1,株,L-,苏氨酸产生菌,ZT01,菌株,(AHVr,、,AECr,、,SAM-),，在培养条件适当时可积累苏氨酸,16mg,m1,。,四、缬氨酸发酵,缬氨酸与赖氨酸、苏氨酸一样同为必需氨基酸之一。,缬氨酸产生菌多为肠杆菌科细菌。这一氨基酸的生物合成途径如下：,葡萄糖丙酮酸乙酰乳酸,-,酮戊二酸缬氨酸,根据缬氨酸生物合成的代谢调节，主要是,-,乙酰乳酸合成酶受缬氨酸反馈调节和途径中有关酶受分支链三种氨基酸的多价阻遏。,选育缬氨酸结构类似物抗性突变株，同时解除除三种氨基酸对酶生成的多价阻遏。如,-,氨基丁酸抗性突变株（,-AB,r,）。,第三节 核苷酸发酵,核酸由众多的单体核苷酸通过,3,5,磷酸二酯键聚合而成。,核苷酸由,碱基、核糖、磷酸,组成。,脱去磷酸后的碱基称为核苷。,（一）呈味核苷酸,核苷酸类中的肌苷酸（,IMP,）、鸟苷酸（,GMP,）、黄苷酸（,XMP,）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜,40,倍，鸟苷酸钠比味精鲜,160,倍。,5,鸟苷酸,5,肌苷酸,5,黄苷酸,（,guanylic acid,）（,inosinic acid,）（,xanthylic acid,）,5,-GMP 5,-IMP 5,-XMP,碱基 鸟嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤,鲜味剂的协同效应,当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时，鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。,增效：甜味、肉味,消除：咸、酸、苦味、腥味、焦味,历史,1913,年，日本科学家发现,5,-IMP,具有强烈鲜味。,60,年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质的最大生产国。,市场上的,“,强力味精,”,、,“,加鲜味精,”,是在普通的味精中加少量肌苷酸钠组成。,70,年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视,。,（二）生产方法,1.,发酵法,（,1,）一步法：直接发酵法,（,2,）二步法（发酵转化法）,发酵法 核苷 核苷酸,2.,酶解法,酵母 核糖核酸,核苷酸,提取,酶解,磷酸化,二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控,（一）生物合成途径,葡萄糖,HMP,5,磷酸核糖,磷酸核糖焦磷酸（,PRPP,）,PRPP,转酰胺酶,5,-IMP,AMP SAMP XMP GMP,AMP-S AMP,IMP,XMP GMP,Asp,Gln,NAD,+,AMP,ADP,ATP,ADP,ATP,激酶,ADP,ATP,激酶,GMP,GDP,GTP,ADP,ATP,激酶,ADP,ATP,激酶,IMP,合成途径的代谢调控,主要通过产物的负反馈调节,ATP,GTP,R-5-P,ATP,PRPP,合成酶,PRPP,酰胺,转移酶,PRA,IMP,AMPS,AMP,ADP,XMP,GMP,GDP,IMP,AMPS,XMP,AMP,ADP,GMP,GDP,GTP,ATP,ATP,GTP,2.,补救合成途径（,salvage synthesis,）,微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成单核苷酸。,当全生物合成途径受阻时，微生物可通过此途径合成核苷酸。,有下面的合成途径：,（,1,）嘌呤碱与,PRPP,直接合成嘌呤核苷酸,次黄嘌呤,次黄嘌呤核苷酸,鸟嘌呤,鸟嘌呤核苷酸,次黄嘌呤,-,鸟嘌呤,磷酸核糖转移酶,(HGPRT),PRPP,PPi,腺嘌呤,腺嘌呤核苷酸,腺嘌呤磷酸核糖转移酶,（,APRT,）,HGPRT,活性高,APRT,活性低,90%,嘌呤碱,三、肌苷酸的生产,（一）一步法,1.,肌苷酸生产菌选育,（,1,）解除微生物自身的反馈调节,a.,解除,AMP,、,GMP,对,PRPP,合成酶和转酰胺酶的反馈抑制。,b.,切断,5,-IMP,继续代谢生成,GMP,和,AMP,的途径。,因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌（,Brevibacterium ammoniagene,）为出发菌株，诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤缺陷型突变株。,（,2,）改变核苷酸对细胞膜的渗透性,核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过细胞膜。,日本科学家发现，,Mn,2+,对于产氨短杆菌核苷酸的膜透性起着关键作用，,Mn,2+,限量的情况下，菌体产生膨胀异常现象，细胞膜允许,IMP,渗透到胞外，积累,IMP,。,Mn,2+,限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。,Mn,2+,亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、不规则）,生物素亚适量：为乙酰,CoA,羧化酶的辅基，影响脂肪酸生物合成，间接影