基因工程-2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第三章 基因工程的常用载体,1,主要内容,载体的功能及特征,质粒（plasmid）,噬菌体,M13噬菌体,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,2,作用一：,作为运载工具，将外源基因,转移,到受体细胞中去。,作用二：,为外源基因提供,复制,能力或,整合,能力,作用三：,为外源基因的,扩增,或,表达,提供必,要的条件,（一）载体的作用,3,细胞内独立的能够自我增殖的结构单位为,复制子,；,包括与,复制控制有关,的结构和与,复制控制无关,的,结构；,细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是 多个复制子的复合体。,6,可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。还有开环（ocDNA）和线状两种状态。,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用（不同于线粒体）。,是基因工程,最常用的运载体。,7,2、质粒的种类,Col质粒,：大肠杆菌素因子。产生大肠杆菌素。F质粒,：致育因子，可借此与其他细菌接触，,传递质粒DNA。,R质粒：抗药因子，可控制细菌产生灭活药物,的酶，或降低细胞膜对药物的通透,性，可对某些抗生素产生抗性。已成,为耐药性基因之源。,8,抗药性包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap）,氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm）,对金属离子抗性,砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+）,9,（1）自主复制性,是能独立复制的复制子。,质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。,3、质粒的基本特征,10,根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型,复制控制的质粒（stringent plasmid）：复制与宿主的繁殖相耦联，受寄主复制起始蛋白控制，,1-3 拷贝,松弛型,复制控制的质粒（relax plasmid）：,复制不与宿主的繁殖相耦联，几十至几百拷贝,（2）可扩增性,11,（3）不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,12,两种含有,不同复制子,结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,13,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如含F因子质粒等；,非接合型质粒,不能在天然条件下独立地发生接合作用；,目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。,（4）可转移性,14,质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，常见性状包括：,抗生素抗性（如,抗四环素、Amp、Kan）,重金属离子抗性基因、复杂有机物的分解基因。它们通常是宿主细胞生长所非需的。,颜色反应（如蓝白筛选）,（5）携带特殊的遗传标记,15,4、质粒改造构建,天然质粒往往存在不同程度的缺陷，因而不适合用作 基因工程的载体必须对之进行改造构建：,（1）具有复制起始点,具有复制子的功能，且起始区域没有所需的酶切位点。,（2）加入合适的选择标记基因,如两个以上，易于用作选择。,（3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组,16,（4）分子量尽可能小,缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，,增加装载量,（5）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝,（6）应为非传递性质粒,17,5、质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒,突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒,来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,测序质粒,含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒,装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合,穿梭质粒,装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆,表达质粒,装有强化外源基因表达的转录翻译、纯化的元件,探针质粒,装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,18,6、实验室常用质粒,优点：,1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。,2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。,3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,pBR322,19,特点：,1）分子量小，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。,2）抗性和蓝白筛选,易于,检测,。,3）多克隆位点区（MCS）.,pUC系列,20,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ）,半乳糖苷酶基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：,链和链,。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。,这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。,蓝白筛选原理,21,lacZ（lacZ）中含有多克隆位点，当,无外源DNA,片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的lacZ基因产物（链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现,兰色,；外源基因的,插入,后，破坏了lacZ-肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈,白色,。,22,半乳糖苷酶基因的优点:,a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测,直观,b.lacZ编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性,c.lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,23,pUC衍生载体,T7和SP6启动子,可进行体外转录,24,由人工构建的具有,两种不同复制起点,和选择标记，因而可在,两种不同寄主细胞,中,进行存活和复制的质粒载体。,大肠杆菌-酵母，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌,穿梭质粒,25,T7 promoter：,T7 特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli,BL21（DE3）等。,原,核,表,达,载,体,26,7、质粒DNA的分离纯化,最常用的方法为,碱裂解法,原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。,用此方法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐，,且质粒中有开环现象。,27,图1 图2,超螺旋环状线状,28,质粒大小应以线性,状态做判断,6kb,1 2 3 4 5 6 7,1、2、3、5：单一酶切位点,4：两个酶切位点,7：未酶切质粒,29,分子量，拷贝数多,为内切酶提供切点的机会小,容易提取,质粒载体的优缺点,优点,克隆片段小，小于10kb,缺点,30,噬菌体是一类非细胞微生物，能,高效率高特异性,地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。,（二）噬菌体,1、噬菌体介绍,31,温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体（双链）,烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体,32,噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,噬菌体由外壳包装蛋白和,-DNA,组成,-DNA,全长,48502,个核苷酸,-DNA,上至少有,61,个基因（必要，,非必要基因）,2、噬菌体生物结构,33,线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互,补单链（粘性末端），称为cos区。,34,3、噬菌体感染周期,35,噬菌体的包装,36,4、噬菌体的溶原状态,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接,整合,到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。,人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态。,DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态 。,37,1）缩短长度,2）删除多余的酶切位点,3）加装选择标记,4）构建琥珀型密码子突变体,5、-DNA载体的构建策略,38,插入型载体,由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。,DNA中缺失部分部分非必要基因，只含有一个供外源基因插入的酶切位点的DNA载体。,39,取代型载体,*36-51 kb为包装的上下限,DNA的可替换片段两端具有两个酶切位点，酶切后替换片段,与带有所有必需基因的左右两臂分开，由外源DNA片段取代。,40,选择标记,与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,41,加装选择标记,imm434（,免疫功能,插入失活,）,imm434,基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,。,这种形态学上的差异，为分离重组体提供了方便的标志。,42,插入失活：,外源DNA克隆到插入型,载 体上，会使噬菌体的某种生物功能丧失 效力，即所谓的插入失活效应。,43,lacZ（,-半乳糖苷酶插入失活）,lacZ,基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因,插入,到,lacZ,基因中，基因灭活，不能降解X-gal，不能合成蓝色化合物，形成,无色,空斑；而,空载,体,-DNA则产生,蓝色,透明斑。,44,4）构建琥珀型密码子突变体,琥珀型突变,（,sup,),：,是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。,将野生型-DNA上两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。,基因工程实验中用的菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。,45,-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染,力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬,菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,6、-DNA重组分子的体外包装,46,这些包装蛋白通常分为,相互互补的两部分：,一部分缺少头部的,E,组份，,另一部分则缺少头部的,D,组份。,包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,47,8、-DNA及其重组分子的分离纯化,1.大肠杆菌培养至对数生长期,2.加入,-噬菌体悬浮液，37培养1小时,3.用新鲜培养液稀释，继续培养4-12小时,4.高速离心，沉淀噬菌体,5.酚抽提，释放,-DNA,6.乙醇或异丙醇沉淀DNA,48,9、,-DNA作为载体的优点：,-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组-DNA分子的筛选较为方便,重组-DNA分子的提取较为简便,-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,49,-DNA载体的装载量最大为25 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。,柯斯质粒(cos site-carrying plasmid)就是含有-DNA两端,cos区,和,质粒复制子,的杂种质粒载体。,（三）柯斯质粒,1、柯斯质粒的定义,50,由于,-DNA包装时，其包装蛋白只识别,粘性末端（cos）,附近的一小段顺序，均1.7kb长，通过特异切割体系，将多联体分子切割，然后进行包装。,2、构建柯斯质粒载体的思路,51,将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建柯斯质粒载体的思路。,52,与,噬菌体DNA不同,的是：柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞。,相同,的是：可体外包装，具有感染性。,与,质粒相同的,是：柯斯质粒具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进行复制。它的制备与质粒相同。,不同的,是兼有噬菌体的某些性质。,53,可以装载比质粒或,-DNA大得多的外源DNA,片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长,为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载,47kb,的,外源DNA。,装载量大,54,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段，此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,（四）人工染色体载体,55,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的,复制区,(自主复制序列，ARS),、分配区,(着丝粒序列，CEN),、稳定区（,端粒 序列，TEL）与质粒组装在一起，即可构成,染色体载体,。,当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,56,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人工染色体,（BAC）装载量范围,在50-300 kb之间。,酵母人工染色体,（YAC）YAC载体的,装载量为350 400 kb。,57,58,