资源描述
,考点一,考点二,第,29,讲微生物利用、,浅尝当代生物技术,第1页,考点一微生物利用,一、大肠杆菌培养和分离,1,.,大肠杆菌,(1),特征：革兰氏,、,肠道杆菌。,(2),细菌繁殖：以,方式繁殖，分裂速度很快。,2,.,细菌扩大培养,扩大培养用,培养基。,3,.,分离,划线分离用,培养基。,阴性,兼性厌氧,分裂,LB,液体,LB,固体平面,第2页,培养基灭菌,_,_,划线分离,培养观察,菌种保留,50 mL LB,液体培养基和,50 mL LB,固体培养基及培养皿,_,灭菌,将培养基分别倒入4个灭菌后培养皿中，水平放置，使之形成平面,在装有液体培养基_中接种大肠杆菌，培养12 h,用接种环在接种有大肠杆菌三角瓶中蘸菌液_，在固体培养基平板上_，盖好培养皿,培养皿_(盖在下面)，放在37 恒温培养箱中培养1224 h，可看到划线末端出现不连续_,在无菌操作下将单菌落用_取出，再用_法接种在_上，_培养24 h后，置于_中保留,倒平板,接种,高压蒸汽,三角瓶,一次,连续划线,倒置,单个菌落,接种环,划线,斜面,37,4,冰箱,第3页,4.,消毒和灭菌比较,条件,结果,惯用方法,应用范围,消毒,较为温和物理或化学方法,仅杀死物体表面或内部部分对人体有害微生物,紫外线消毒法,接种室、,_,化学药剂消毒法,用,_,擦拭双手，用氯气消毒水源,灭菌,强烈理化原因,杀死物体内外_微生物，包含_,灼烧灭菌法,_,干热灭菌法,玻璃器皿、金属工具,高压蒸汽灭菌法,_及容器灭菌,过滤除菌,不能_化合物，要用G6_过滤,超净台,酒精,全部,芽孢和孢子,接种工具,培养基,加热灭菌,玻璃砂漏斗,第4页,二、分离以尿素为氮源微生物,1,.,菌种特点,含有,_,，能够经过降解,_,作为其生长氮源。,2,.,培养基,用以,为唯一氮源培养基培养，以,培养基为对照。,3,.,试验原理,(1),筛选以尿素为氮源微生物，可使用以尿素为唯一氮源,培养基进行培养选择。,(2),细菌合成脲酶能将尿素分解成,，致使,pH,升高，使酚红指示剂,。,NH,3,脲酶,尿素,尿素,LB,全营养,选择,变红,第5页,4,.,试验步骤,无菌水,涂布分离,三个,玻璃刮刀,24,48,第6页,5,.,反应判定,在配制培养基时，加入指示剂,，培养时细菌将尿素分解产生碱性氨，使培养基上菌落周围出现,。,酚红,红色环带,第7页,6,.,微生物接种两种惯用方法比较,比较,划线分离法,涂布分离法,工具,接种环,玻璃刮刀,原理,经过_在固体培养基表面连续划线操作，将聚集菌种逐步_到培养基表面。在数次划线后培养，能够分离到由一个细菌细胞繁殖而来肉眼可见细胞群体，即_,将菌液用_进行梯度稀释，然后将不一样稀释度菌液分别用_涂布到固体培养基表面，进行培养。在稀释度足够高菌液里，聚集在一起微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成_,特点,方法简单，但,_,计数,单菌落,_,，但操作复杂些,目标,使培养基上形成单个细菌细胞繁殖而来子细胞群体菌落,接种环,稀释分散,菌落,无菌水,涂布器,单个菌落,不宜,更易分开,第8页,1.,(10,月浙江选考节选,),科研人员拟将已知花色基因,(,目标基因,),转入矮牵牛核基因组中，培育新花色矮牵牛。请回答：,用,_,玻璃刮刀将稀释后大肠杆菌液,_,接种到含有抗生素固体培养基上，经培养形成,_,，再进行判定和扩大培养。,第9页,解析,在细菌涂布分离时，采取灭菌玻璃刮刀将稀释后菌液均匀涂布在固体培养基上，经培养形成单菌落，再进行判定和扩大培养。,答案,灭菌涂布菌落,第10页,2.,(10,月浙江选考节选,),请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化试验相关问题：,(1)LB,固体培养基：取适量蛋白胨、酵母提取物、,NaCl,，加入一定量蒸馏水溶解，再加,_,，灭菌备用。,(2),尿素固体培养基：先将适宜浓度尿素溶液用,_,灭菌过,G6,玻璃砂漏斗过滤，因为,G6,玻璃砂漏斗,_,，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加到已经灭菌含有酚红培养基中，备用。,第11页,(3),取适量含产脲酶细菌,10,4,、,10,5,两种土壤稀释液，分别涂布接种到,LB,固体培养基和尿素固体培养基上，培养,48 h,，推测固体培养基上生长菌落数量最少是,_,。,A.10,5,稀释液尿素固体培养基,B.10,5,稀释液,LB,固体培养基,C.10,4,稀释液尿素固体培养基,D.10,4,稀释液,LB,固体培养基,在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现,_,，其原因是细菌产生脲酶催化尿素分解产生,_,所致。,第12页,解析,(1),本试验中,LB,培养基是要与尿素培养基作对比，所以要用琼脂糖替换琼脂。,(2),尿素培养基灭菌要分开进行，除尿素外其它成份仍用高压蒸汽灭菌，尿素溶液用,G6,玻璃砂漏斗过滤除菌，再将除菌尿素加到已灭菌其它成份中。,G6,玻璃砂漏斗因为孔径小，细菌不能滤过，可用于过滤除菌，但需要在使用前进行高压蒸汽灭菌。,(3),因为在土壤中产脲酶细菌远小于普通细菌，所以在尿素培养基上菌落数相对少得多，另外稀释倍数高土壤稀释液中细菌数量少，在培养基上菌落数也相对少。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现红色环带，这是因为脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂在碱性下呈红色。,第13页,答案,(1),琼脂糖,(2),高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过,(3)A,红色环带氨,(,或,NH,3,),第14页,3.,(4,月浙江选考节选,),回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定相关问题：,制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少许酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用,_,蘸取少许稀释液，在,MRS,乳酸菌专用培养基平板上划线，以取得乳酸菌单菌落。下列图所表示划线分离操作，正确是,_,。,第15页,解析,从酸奶中分离乳酸菌时，可采取划线分离，方法是用接种环蘸取少许稀释液，在,MRS,乳酸菌专用培养基平板上划线，以取得乳酸菌单菌落。图示划线分离中,B,图方法是正确，,A,图不分区划线，但划线太稀疏了，分离效果很差，,B,、,C,、,D,都采取了分区划线，但,C,、,D,都没有注意除第一区外，之后每区划线第一条线都需要从上一区划线末端开始。,答案,接种环,B,第16页,本题组对应选修一,P19,P28,，微生物利用,1.,大肠杆菌是革兰氏阴性、,肠道杆菌，是,技术中被广泛采取工具。,2.,培养基是指微生物生存,和,，普通都含有五大营养要素：即：,、,、,、,、,。普通来讲，,“,细菌喜荤、霉菌喜素,”,，大肠杆菌普通采取,培养基，其主要成份为,、,、氯化钠、水等，若要扩大培养，则采取,培养基，若要分离取得纯种，则采取,培养基，这二者主要区分在于后者加入了,。霉菌培养基普通用,配制成或添加,豆芽汁。,兼性厌氧,基因工程,环境,营养物质,水,无机盐,碳源,氮源,生长因子,LB,蛋白胨,酵母提取物,LB,液体,LB,固体,琼脂,无机物,蔗糖,第17页,3.,单菌落分离是,通用方法，也是用于筛选,菌株最简便方法之一。惯用分离方式有,分离法、,分离法两种。它们都采取,培养基。其中涂布分离法单菌落,，而且可用来,菌体数目，但操作,，且往往要先将培养菌液,；而,分离操作简单，但不能用于计数。,消除污染杂菌,高表示量,划线,涂布,固体平面,更易分开,计数,复杂些,稀释,划线,第18页,4.,菌种保留往往选取,培养基，于,中保留。用灼烧后接种环从斜面取菌种时，往往要先使接种环接触,以到达,目标，然后再取菌体。,5.,接种完成后应将培养皿,培养，目标是：预防水蒸气凝结成水滴落入,冲散菌落，影响单菌落,。,固体斜面,4,冰箱,培养基,冷却,倒置,培养基表面,形成和分离,第19页,6.,灭菌操作：培养基、培养皿、试管、三角瓶、枪头、接种环、镊子等用具通惯用,灭菌，这些用具通常需要用,_,或报纸包好，其中容器先要用,_,封口再包好，放入灭菌锅中，在,_,(,_,压力,),下灭菌,_,min,。试验用棉花不能用,_,，因,_,易吸水，吸水后轻易引发污染。假如培养基中有葡萄糖，为预防葡萄糖分解碳化，要用,_,g/cm,2,压力,(,_,以上,),灭菌,_,min,。因为尿素加热会分解，只能用,_,过滤除菌，但玻璃砂漏斗使用前也要在,_,下用纸包好灭菌，用后还需用,1 mol/L,_,浸泡，并,_,，再用,_,洗至洗出液呈中性，,_,后保留。将培养基转移到三角瓶和试管中时必须用,_,，以免培养基沾到,和,，发生污染。,高压蒸汽,牛皮纸,棉塞或封口膜,121,1 kg/cm,2,15,脱脂棉,脱脂棉,500,90,30,G6,玻璃砂漏斗,121,HCl,抽滤去酸,蒸馏水,干燥,三角漏斗,三角瓶口,试管口,第20页,7.,无菌操作通常在,中进行，超净台使用前,min,，打开,和,，注意打开紫外灯后,，使用时必须关闭,。,超净台,30,紫外灯,过滤风,人必须离开,紫外灯,第21页,角度微生物利用,1.,(,嘉兴期末节选,),以下相关大肠杆菌培养试验，请回答：,(1),配制培养大肠杆菌培养基时，依据,“,细菌喜荤，霉菌喜素,”,规律，通常在培养基中加入蛋白胨和,_,作为营养物质，为维持一定渗透压，常需加入一定量,_,。,第22页,(2),大肠杆菌培养和分离试验中，在,_,中进行扩大培养，培养液经,_,后，在,LB,固体培养基上进行,_,，并将培养皿,_,放在恒温培养箱中培养，能够取得如图效果。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及,_,，应同时将未接种培养基放入恒温培养箱培养。,第23页,(3),通常对取得纯菌种能够依据,_,形状、大小等特征进行初步判定。,(4),关于,“,大肠杆菌培养和分离,”,操作中，以下叙述正确是,_,。,A.,高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖,B.,倒平板时，应将打开皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上,C.,为了预防污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落,D.,用记号笔标识培养皿中菌落时，应标识在皿底上,第24页,解析,(1),配制培养细菌培养基通惯用,LB,培养基，其成份有蛋白胨、酵母提取物、,NaCl,、水等，固体培养基还有琼脂。其中蛋白胨、酵母提取物提供营养，,NaCl,提供无机盐并调整,渗,透压,，琼脂是凝固剂。,(2),细菌培养通惯用,LB,液体培养基进行扩大培养和生产，用固体培养基进行分离、判定、保留菌种。菌种分离有划线法和涂布法，进行涂布分离时，选稀释菌液，再进行涂布，完成后将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养，可取得分布均匀单菌落。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及培养基灭菌是否彻底，应同时将未接种培养基放入恒温培养箱培养。,(3),菌落形状、大小等特征能够作为判定依,第25页,据。,(4),高压灭菌加热结束后，自然冷却待压力表指针回到零后，开启锅盖，,A,错误；倒平板时，应将打开上盖一边，将培养基倒入培养皿，再盖上培养皿上盖，将培养皿置于水平位置，轻轻晃动，使培养基铺满底部，待其凝固，,B,错误；接种时接种工具经灼烧灭菌后，需先接触培养基使其冷却后，再挑取菌落，,C,错误；因为培养皿是倒置放在恒温培养箱中培养，所以用记号笔标识培养皿中菌落时，应标识在皿底上，,D,正确。,答案,(1),酵母提取物,NaCl,(2)LB,液体培养基稀释涂布分离倒置培养基灭菌是否彻底,(3),菌落,(4)D,第26页,2.,(,金丽衢十二校节选,),普通酵母菌直接利用淀粉能力很弱，有些人将地衣芽孢杆菌淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉工程酵母菌菌种,(,过程如图,1,所表示,),第27页,(1),图,1,中，为到达筛选目标，平板内固体培养基应以,_,作为唯一碳源。,过程需重复几次，目标是,_,_,。,(2),某同学尝试过程,操作，其中一个平板经培养后菌落分布如图,2,所表示。该同学接种方法是,_,；推测该同学接种时可能操作失误是,_,。,(3),上述工程酵母菌培养过程中，相关操作正确是,_,。,A.,玻璃刮刀用火焰灼烧进行灭菌,B.,培养基分装到培养皿后进行灭菌,C.,倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行,D.,取得菌种假如需要保留，可置于,37,恒温保留,第28页,解析,(1),为筛选得到高效利用淀粉工程酵母菌菌种，固体培养基应以淀粉作为唯一碳源。屡次重复筛选是为取得高效利用淀粉工程酵母菌纯化菌种。,(2),由图,2,结果表明，该同学采取是涂布分离法，其操作失误是涂布不均匀，造成平板上菌落未均匀分布。,(3),涂布操作用玻璃刮刀通常保留在,70%,酒精中，使用前引燃酒精，火焰熄灭后待其冷却后使用；培养基通常先灭菌，后趁热倒平板；保留菌种通常使用斜面培养基，在,4,冰箱中保留；倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行，这是无菌操作要求。,答案,(1),淀粉筛选出真正高效利用淀粉工程酵母菌菌种,(2),涂布分离法涂布不均匀,(3)C,第29页,1,.,培养基种类,划分标准,培养基种类,特点,用途,物理性质,液体培养基,不加凝固剂,工业生产、扩大培养,半固体培养基,加凝固剂，如琼脂,观察微生物运动、分类、判定,固体培养基,微生物分离、判定、活菌计数、保藏菌种,化学成份,天然培养基,含化学成份不明确天然物质,工业生产,合成培养基,培养基成份明确(用化学成份已知化学物质配成),分类、判定,第30页,用途,选择培养基,培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要微生物生长，促进所需要微生物生长,培养、分离出特定微生物,判别培养基,依据微生物代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品,判别不一样种类微生物,第31页,2.,培养基营养要素,基本营养要素：各种培养基普通都含有水、碳源、氮源、无机盐。另外还要满足不一样微生物生长对,pH,、特殊营养物质以及氧气需求。,第32页,营养要素,起源,功效,碳源,无机碳源,CO,2,、,NaHCO,3,、,CaCO,3,等含碳无机物,组成细胞中物质和一些代谢产物；既是碳源又是能源,有机碳源,糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等,氮源,无机氮源,无机氮：,NH,3,、铵盐、硝酸盐、,N,2,等,将无机氮合成含氮代谢产物,有机氮源,牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸,合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物,生长因子,维生素、氨基酸、碱基,酶和核酸组成成份；参加代谢过程中酶促反应,第33页,考点二浅尝当代生物技术,1,.,植物组织培养原理,(1),理论基础：植物细胞含有,。,(2),植物组织培养基本过程,全能性,脱分化,再分化,第34页,(3),植物组织培养影响原因,选材：不一样植物组织或同一植物组织不一样部分，培养难易程度差异很大，菊花组织培养，普通选择,茎上部,侧枝。,培养基：植物组织培养需要适宜培养基，惯用是,MS,培养基，在配制好培养基中，经常需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。试验中使用生长素类似物是,，细胞分裂素类似物是,。,其它条件：,pH,、温度和光照等条件对植物组织培养也很主要。,未开花植株,新萌生,萘乙酸（,NAA,）,苄基腺嘌呤（,BA,）,第35页,2,.,菊花组织培养过程,乙醇,次氯酸钠,无菌水,酒精灯火焰,灼烧灭菌,第36页,发芽,BA,NAA,18,25,丛状苗,生根,NAA,蛭石,80%,自然湿度,第37页,(10,月浙江选考节选,),科研人员拟将已知花色基因,(,目标基因,),转入矮牵牛核基因组中，培育新花色矮牵牛。请回答：,(1),取田间矮牵牛幼嫩叶片，经自来水冲洗，先用,70%_,浸泡，再用,5%,次氯酸钠浸泡，最终用,_,清洗，作为转基因受体材料。,(2),取出试管苗，在适宜光照、温度和,80%,以上,_,等条件下进行炼苗。,第38页,解析,(1),用作组培外植体若取自自然环境则需要消毒，方法是外植体经自来水冲洗，先用,70%,酒精浸泡，再用,5%,次氯酸钠浸泡，最终用无菌水清洗，才能用于接种。,(2),组培时，试管苗需经炼苗才能定植，炼苗时需将试管苗从培养瓶中取出，移栽至,具,适宜光照、温度和较低湿度环境中。,答案,(1),酒精无菌水,(2),湿度,第39页,本题组对应选修一,P59,P61,，植物组织培养,1.,组织培养就是取一部分,_,，如根、茎、花瓣、叶或花粉等，在,条件下接种在三角瓶中,_,上，给予一定光照和温度，使之产生,，或进而,。组织培养必须在培养基中加入,和,。二者,决定组织是生根还是生芽。当细胞分裂素与生长素百分比,时，诱导,生成，二者百分比大致,_,时，愈伤组织继续,_,；当细胞分裂素与生长素百分比较,时，会趋于生,。,植物组织,无菌,琼脂培养基,愈伤组织,生根发芽,生长素,细胞分裂素,摩尔浓度比,高,芽,相等,生长而不分化,低,根,第40页,2.,本试验首先用细胞分裂素相对较,和生长素相对较,培养基进行培养，取得,；然后将丛状苗,培养。分株后，再移入含较多,培养基中，使其生根；将生根苗从三角瓶中移至,或,中继续生长；苗健壮后再移至,。,多,少,发芽,丛状苗,分株,生长素,生根,草炭土,蛭石,土中,第41页,角度植物组织培养,1.,某愈伤组织在以下列图甲所表示培养基中培养一段时间后得到如图乙所表示结构，经分析可知该培养基中,(,),A.,细胞分裂素多，生长素少,B.,细胞分裂素少，生长素多,C.,细胞分裂素和生长素用量相等,D.,只有生长素,第42页,解析,从图乙中能够看出该培养基有利于生根且抑制芽形成，所以可推断该培养基中生长素多，细胞分裂素少，,B,正确。,答案,B,第43页,2.,(,温州选考模拟节选,),卡那霉素和头孢霉素都有抗菌作用，另外，卡那霉素还对葡萄细胞有抑制作用。研究人员将,Barnase,基因,(,雄性不育基因,),转入葡萄细胞，利用卡那霉素和头孢霉素，经过植物克隆方法成功培育出大粒、无核葡萄新品种。请回答：,(1),构建含,Barnase,基因、,葡糖苷酸酶基因和卡那霉素抗性基因重组质粒，导入农杆菌，在固体培养基中培养形成,_,方便判定是否混有杂菌，再用,_,将农杆菌转移至,LB_,培养基中进行扩大培养。,第44页,(2),将经过,_,幼嫩葡萄叶片切成小块，浸入农杆菌悬浮液中，,4,分钟后取出,(,此时已经有较多农杆菌附着在叶片小块上,),并接种到固体培养基中。培养至第,3,天时，能够看到在叶片小块周围出现,_,和大量菌落。这时再用头孢霉素处理叶片小块，其目标是,_(A.,抑制葡萄细胞脱分化,B.,促进葡萄细胞再分化,C.,杀灭农杆菌,D.,促进农杆菌生长,),。,(3),将叶片切成小块放入卡那霉素培养基中培养一段时间后，转移至生芽培养基中，待其长出,_,后，再转移至生根培养基中继续培养形成试管苗。卡那霉素培养基起着,_,作用，植物克隆技术基础是,_,。,第45页,(4),在卡那霉素培养基中，因为转化细胞对周围非转化细胞有保护作用，取得试管苗中可能存在假转基因试管苗，所以还需对试管苗,_,基因表示产物进行生化检测，才能判别出真正转基因试管苗。,(5),最终，对转基因试管苗还需进行逐步,_,湿度锻炼，使之适应自然环境。,第46页,解析,(1),构建含,Barnase,基因、,葡糖苷酸酶基因和卡那霉素抗性基因重组质粒，导入农杆菌，在固体培养基中培养形成单菌落方便判定是否混有杂菌，再用接种环将农杆菌转移至,LB,液体培养基中进行扩大培养。,(2),将经过消毒幼嫩葡萄叶片切成小块，浸入农杆菌悬浮液中，然后取出并接种到固体培养基中。培养至第,3,天时，能够看到在叶片小块周围出现愈伤组织和大量菌落。这时再用头孢霉素处理叶片小块，其目标是杀灭农杆菌，从而取得处理葡萄叶片细胞。,(3),将叶片小块放入卡那霉素培养基中培养取得导入目标基因葡萄叶片细胞，转移至生芽培养基中，待其长出丛状苗后，再转移至生根培养,第47页,基中继续培养形成试管苗。卡那霉素培养基起着筛选导入目标基因葡萄叶片细胞作用，植物克隆技术基础是植物组织培养。,(5),最终，对转基因试管苗还需进行逐步降低湿度锻炼，使之适应自然环境。,答案,(1),单菌落接种环液体,(2),消毒愈伤组织,C,(3),丛状苗筛选植物组织培养,(4),葡糖苷酸酶,(5),降低,第48页,生长素和细胞分裂素用量百分比与根、芽分化,生长素和细胞分裂素比值,结果,比值高时,促进根分化，抑制芽形成,比值低时,促进芽分化，抑制根形成,比值适中,促进愈伤组织生长,第49页,
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