分子生物学研究法(上).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,分子的切割与连接,核酸分子杂交,凝胶电泳,细胞转化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因工程,基因的定点突变,PCR,扩增等,核心技术,基因工程：,指在,体外,将,核酸分子,插入病毒、质粒或其它,载体,分子，构成遗传物质的新组合，使之进入,原先没有这类分子的寄主细胞,内并进行,持续稳定的表达和繁殖。,基因工程技术区别于其它技术的,根本特征,：具有跨越天然物种屏障、能把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中。,基因工程的一般过程,1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的,DNA,片段。,2.将带有目的基因的外源,DNA,片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子中，形成重组,DNA,分子。,3.将重组,DNA,分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。,4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组,DNA,分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。,5.将目的基因克隆到,表达载体,上，导入,寄主细胞,，使之在新的遗传背景下实现功能表达，以研究基因的功能及基因与蛋白质之间的关系。,一、重组,DNA,技术回顾,基因工程两大技术保证：,1,.DNA,的体外切割和连接,1962,年,Arber,发现限制性核酸内切酶，,1967年,Gellert,发现了,DNA,连接酶。,重组,DNA,实验中常见的主要工具酶,酶 类,功 能,限制性核酸内切酶,识别并在特定位点切开,DNA,DNA,连接酶,通过磷酸二酯键把两个或多个,DNA,片段连接成一个,DNA,分子,DNA,聚合酶,I,（大肠杆菌）,按,5,到,3,方向加入新的核苷酸，补平,DNA,双链中的缺口,反转录酶,按照,RNA,分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成,DNA,链,多核苷酸激酶,把磷酸基团加到多聚核苷酸链的,5-OH,末端（进行末端标记实验或用来进行,DNA,的连接),末端转移酶,在双链核酸的,3,末端加上多聚单核苷酸,DNA,外切酶,III,从,DNA,链的,3,末端逐个切除单核苷酸,噬菌体,DNA,外切酶,从,DNA,链的,5,末端逐个切除单核苷酸,碱性磷酸酯酶,切除位于,DNA,链,5,或,3,末端的磷酸基团,DNA,片段在体外,不具备自我复制,能力，要想得到足够量和足够纯度的,DNA,，须将它们连接到具备自主复制能力的,DNA,分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。,这就是基因克隆，或分子克隆。,分子克隆的载体,具备自主复制能力的,DNA,分子：,病毒,噬菌体,质粒,基因克隆,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取,DNA,分子,从此，大肠杆菌成为分子克隆中最常用的转化受体。,1970年,Mandel,和,Higa,发现，大肠杆菌经氯化钙处理后，能有效吸收,噬菌体,DNA,。,1972,年，,Cohen,等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌能够摄取质粒,DNA。,细菌转化研究,1972-Paul Berg,得到第一个重组,DNA,分子,Eco,RI recognition sites,phage DNA,Eco,RI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,Herbert Boyer,Stanley Cohen,1973年获得重组,DNA,分子,Herbert Boyer,抗四环素,抗卡那霉素,双抗质粒,1973-Boyer,Cohen&Chang,用重组质粒,转化,E.coli,Herbert Boyer,、,Stanley Cohen,、,Annie Chang,Kanamycin resistance gene,Tetracycline resistance gene,pSC101,结论,:,（1）质粒,DNA,分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源,DNA,导入寄主细胞；,（2）高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（3）质粒,DNA-,大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，在重组,DNA,或基因工程研究中发挥重要作用。,2.,DNA,的核苷酸序列分析技术,DNA,核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发展起来的一门重要的,DNA,技术，这门技术是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有,Sanger,等发明的双脱氧链末端终止法和,Maxam,和,Gilbert,发明的化学降解法。,二、,DNA,基本操作技术,1.核酸凝胶电泳技术,琼脂糖,和聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶：分离大于,200bp,50kb,的片段,;,聚丙烯酰胺凝胶：分离,1,1000bp,的片段,;,用途：,DNA,核,苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、核苷酸多态性分析、,DNA,片段分离等。,基本原理：,电泳分子的,迁移率,与,电场强度,和电泳分子本身所携带的,净电荷数成正比,，与支持介质分子如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等的,摩擦系数成反比,。而摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数,在生理条件下，,DNA,电泳的迁移率，取决于,核酸分子本身的大小和构型,。,凝胶类型及浓度,分离,DNA,片段的大小范围（,bp,）,0.3%,琼脂糖,50 0001 000,0.7%,琼脂糖,20 0001 000,1.4%,琼脂糖,6 000300,4.0%,聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%,聚丙烯酰胺,50025,20.0%,聚丙烯酰胺,501,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,脉冲电场凝胶,:,电场方向、电流大小及作用时间交替变换。,分离相对分子质量超大的,DNA,(50 kb 10,7,bp),凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭对核酸分子进行染色，紫外光下发荧光。,每条,DNA,带中仅含0.05,g,微量,DNA，,也可以被清晰地检测出来。,称样,溶解,加热,制板,倒胶,电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的,DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化,DNA,的菌株叫作供体菌株，接受转化,DNA,的细菌菌株则被称为受体菌株。,处于能够接受外源,DNA,状态的细胞称为,感受态细胞,。,2.,细菌转化与目标,DNA,分子的增殖,细菌转化常用的方法：,CaCl,2,法和电击法。,CaCl,2,法：,将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，造成细胞膨胀，膜通透性改变。,电击法：,电击使细胞膜产生孔洞。,转化体总数,插入频率,转化频率,互补蓝白斑筛选原理。,a-,互补显色反应（蓝白斑筛选）,lacZ,-,-,半乳糖苷酶,-,分解半乳糖苷,i,P,O,调控蛋白,P,分解,X-gal,产物呈现蓝色,诱导剂,IPTG,宿主含有,-,半乳糖苷酶,lacZ,基因的,3,端序列,X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷),肽段,噬菌体重组体,DNA,分子的体外包装法,3.,聚合酶链式反应技术,PCR,技术是一种在体外快速扩增特定基因或,DNA,序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。,DNA,聚合酶,在核苷酸底物存在下，以一条,DNA,链为模板催化新链合成,需要,3-OH,引物,5 到3 方向合成,DNA,通常具有 3到,5,外切酶活性,PCR,扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,PCR Cycle-Step 1,-Denaturation Template DNA by Heat(95,o,C),PCR Cycle-Step 2,Temperature is lowered(T,m,)and primers anneal to target sequences,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR Cycle-Step 3-,At 72,o,C,Taq,DNA polymerase catalyses primer extension,5,3,5,5,3,5,End of the 1st PCR Cycle,Results in two copies of target sequence,每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,。,理论上最高值,2,n,PCR,仪,PCR,技术的应用,1),基因克隆,重组,DNA,质粒,DNA,基因片段,2),基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人,(-),病 人,(+),3,）表达分析,4,）探针制备,5,）定点突变,4,、实时定量,PCR,常规,PCR,方法的局限性：,无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析,必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且,EB,有毒,无法对扩增反应实时检测,Cycle number,Theoretical,Real Life,Log Target DNA,Reality vs.Theory,Amplification is exponential,but the exponential increase is limited:,Theoretical,Log Target DNA,Detector,Cycle#,Real Life,定量的最佳时期,:,指数期,如何知道,PCR,反应什么时候处在指数期、又如何进行检测呢？,实时定量,PCR,是指在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过,标准曲线,对样品中的目的,DNA(,或,cDNA),的,起始浓度,进行定量的方法。,Real-Time PCR,PCR,仪,+,监测、分析系统+,荧光标记,l,l,l,l,非,特异性荧光标记：,SYBR Green,特异性荧光标记：,TaqMan,Molecular Beacon,DNA,产物的荧光标记,SYBR Green,工作原理,SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和,双链,DNA,结合,后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,约,497 nm,约,520 nm,Cleavage Probes(TaqMan,TM,),Taqman,探针：与靶,DNA,序列中间部位结合的单链,DNA,（,50-150 bp,）,Molecular beacon,法,(,分子信标,),标记荧光的发夹探针,环与目标序列互补,茎由互补配对序列组成,环,茎,荧光素 淬灭剂,发夹型杂交探针,定量原理,:,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,如何对起始模板定量？,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,扩增曲线,:,荧光检测元件,扩增曲线可分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。,荧光,阈,值,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号,指数扩增阶段,任意位置上，一般将荧光域值设置为,3-15,个循环的荧光信号标准偏差的,10,倍。,Ct,值,Ct,值定义,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,Ct,值的重现性,:,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Ct,值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：,扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：,初始模板量,Ex,：,扩增效率,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,绝对定量,25,相对定量：通过内标定量,内标通常是,-actin,等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近,100,且偏差在,5,以内,1,、用内参基因的,CT,值确定目标基因的,CT,值：,CT(test)=CT(target,test)CT(ref,test),CT(calibrator)=CT(target,calibrator)CT(ref,calibrator),2,、用校准样本的,CT,值确定试验样本的,CT,值：,CT=CT,（,test)-CT,（,calibrator),3,、计算表达水平比率：,(1+E),CT,=,表达量的比值,相对定量分析法：,-Ct,法,基因文库（,gene library,）：应用,DNA,重组技术构建的含有基因组的全部基因的,DNA,克隆。基因文库,是,包含了某一生物体全部,DNA,序列的克隆群体。,基因文库,包括基因组文库,(Genome library),和,cDNA,文库,(cDNA library),5,、基因组,DNA,文库构建,基因组文库,分离组织或细胞染色体,DNA,，利用限制性核酸内切酶切割成许多片段，将它们与适当的克隆载体连接成重组,DNA,分子，继而转入受体菌中扩增，不同细菌所包含的重组,DNA,分子内可能存在不同的染色体,DNA,片段，这样全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。,存在于转化细菌或噬菌体内、由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合称,基因组,DNA,文库,。,三、,RNA,基本操作技术,1,、总,RNA,的提取,2,、,mRNA,的纯化,用试剂盒提取总,RNA,加入与,生物素相连的寡聚,(dT),引物温育,加入与微磁球相连的抗生物素蛋白,用磁场吸附通过寡聚,(dT),引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的,mRNA,洗脱得到,mRNA,3,、反转录生成,cDNA,以寡聚,dT,或随机,6,核苷酸为引物,反转录酶,cDNA,第一链,以,cDNA,第一链为模板合成,cDNA,第二链,加接头准备与载体连接,4,、,c,DNA,文库构建,双链,cDNA,经限制性内切酶酶切，产生的片段与适当载体连接后转入受体细菌或噬菌体，即获得,cDNA,文库,。,与基因组,DNA,文库类似，由总,mRNA,制作的,cDNA,文库包含了细胞表达的各种,mRNA,信息,。,基因组,DNA,文库,DNA,文库,限制性内切酶,cDNA,基因重组,转化细菌,体外包装,cDNA,噬菌粒文库,噬菌粒的包装,含有,cDNA,插入片段的重组噬菌粒,DNA,体外蛋白质外壳的包装反应,有侵染和复制能力的成熟噬菌体,进行基因组学的研究,含有某种组织或器官的噬菌粒文库,5,、基因文库的筛选,1,）核酸杂交法,2,）,PCR,法,3,）免疫筛选法,Thank you!,