分子生物研究法(上).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,从,20,世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。,基因操作主要包括,DNA,分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和,PCR,扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。,事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,5.1,重组,DNA,技术回顾,5.2 DNA,基本操作技术,5.3 RNA,基本操作技术,5.4 SNP,的理论与应用,5.5,基因克隆技术,5.6,蛋白质组与蛋白质组学技术,5.1.1,三大奠基,成就,：,DNA,的结构及复制；,5.1,重组,DNA,技术发展史回顾,DNA,是遗传物质；,DNA,的遗传和表达规律,中心法则。,40,年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是,DNA,而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,Bacterial,Strain,Injection,Results,Living S cells,Living R cells,Heat killed S cells,Heat killed S cells mixed with living R cells,Living S cells in blood sample from dead mouse,capsule,1928,Frederick Griffith,&1944 Oswald,Avery,Transformation of,Streptococcus pneumoniae,1952年,Hershey,和,Chase,证实噬菌体,DNA,侵染细菌,实验,Description of the 3-D structure of DNA,Francis Crick&James Watson,Conservative Model,Semiconservative Model,Frank Stahl,Matt Meselson,Parent cell,First replication,Second replication,1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway,50,年代末至,60,年代，相继提出了,中心法则,和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,Jacob and Monod,DNA,提取技术：如果没有分离和富集单一,DNA,分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。,5.1.2 DNA,操作技术,DNA,的体外切割和连接,1962,年,Arber,发现限制性核酸内切酶，,1967Gellert,发现了,DNA,连接酶,DNA ligase covalently links two DNA strands,Restriction,enzyme,Restriction,enzyme,Ligase,Ligase,3,5,3,5,Herbert Boyer,Paul Berg(,美国斯坦福大学,),于,1972,年获得第一个重组,DNA,分子,H.Boyer,P.Berg,SV40 DNA,Recombinant DNA,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和,DNA,连接酶进行,DNA,的切割和重组远不能满足基因研究的需要。,DNA,片段在体外,不具备自我复制,能力，要想得到足够量和足够纯度的,DNA,，必须将它们连接到具备自主复制能力的,DNA,分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。,这就是基因克隆，或分子克隆。,基因克隆技术,分子克隆的载体,-,具备自主复制能力的,DNA,分子（,vector,），如,病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,大肠杆菌成为分子克隆中最常用的转化受体。,1970,年,Mandel,和,Higa,发现，大肠杆菌细胞经适量,CaCl,2,处理后，能有效地吸收,噬菌体,DNA,。,1972,年，,Cohen,等人又报道，经,CaCl,2,处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒,DNA,。,1973-Boyer,Cohen&Chang,Transform,E.coli,with recombinant plasmid,Stanley Cohen&Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E.coli,transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,非洲爪蟾,表明：,（,1,）像,pSC101,这样的质粒,DNA,分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源,DNA,导入寄主细胞；,（,2,）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（,3,）质粒,DNA-,大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，在重组,DNA,或基因工程研究中发挥重要作用。,重组,DNA,实验中常见的主要工具酶,酶 类,功 能,限制性核酸内切酶,识别并在特定位点切开,DNA,DNA,连接酶,通过磷酸二酯键把两个或多个,DNA,片段连接成一个,DNA,分子,DNA,聚合酶,I,（大肠杆菌）,按,5,到,3,方向加入新的核苷酸，补平,DNA,双链中的缺口,反转录酶,按照,RNA,分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成,DNA,链,多核苷酸激酶,把磷酸基团加到多聚核苷酸链的,5-OH,末端（进行末端标记实验或用来进行,DNA,的连接,末端转移酶,在双链核酸的,3,末端加上多聚单核苷酸,DNA,外切酶,III,从,DNA,链的,3,末端逐个切除单核苷酸,噬菌体,DNA,外切酶,从,DNA,链的,5,末端逐个切除单核苷酸,碱性磷酸酯酶,切除位于,DNA,链,5,或,3,末端的磷酸基团,到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何,DNA,分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,DNA,的核苷酸序列分析技术,DNA,核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发展起来的一门重要的,DNA,技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆,DNA,片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。,5.1.3,重组,DNA,技术历史上的主要事件,年份,事,件,1869,F Miescher,首次从莱茵河鲑鱼精子中分离,DNA,。,1944,O.T.Avery,证实,DNA,是遗传物质。,1952,A.D.Hershey,和,M.Chase,再次证实和噬菌体的遗传物质是,DNA,。,1953,J.D.Watson,和,F.H.C.Crick,提出,DNA,分子结构的双螺旋模型。,M.Wilkins,用,X-,射线衍射法证实了这一结构。,1957,A.Kornberg,从大肠杆菌中发现了,DNA,聚合酶,I,。,1958,M.Meselson,和,F.W.Stahl,提出了,DNA,的半保留复制模型。,1959-1960,S.Ochoa,发现,RNA,聚合酶和信使,RNA,，并证明,mRNA,决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。,1961,Nirenberg,破译了第一相遗传密码；,F.Jacob,和,J.Monod,提出了调节基因表达的操纵子模型。,1964,C.Yanofsky,和,S.Brenner,等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。,1965,S.W.Holley,完成了酵母丙氨酸,tRNA,的全序列测定；,科学家证明细菌的抗药性通常由,质粒,DNA,所决定。,1966,M.W.Nirenberg,，,S.Ochoa,、,H.G.Khorana,、,F.H.C.Crick,等人破译了全部遗传密码。,1970,H.O.Smith,，,K.W.Wilcox,和,T.J.Kelley,分离了第一种限制性核酸内切酶。,H.M.Temin,和,D.Baltimore,从,RNA,肿瘤病毒中发现反转录酶。,1972-1973,H.Boyer,，,P.Berg,等人发展了,DNA,重组技术，于,72,年获得第一个重组,DNA,分子，,73,年完成第一例细菌基因克隆。,1975-1977,F.Sanger,与,A.Maxam,、,W.Gilbert,等人发明了,DNA,序列测定技术。,1977,年完成了全长,5387bp,的噬菌体,174,基因组测定。,1978,首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。,1980,美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。,1981,R.D.Palmiter,和,R.L.Brinster,获得转基因小鼠；,A.C.Spradling,和,G.M.Rubin,得到转基因果蝇。,1982,美、英批准使用第一例基因工程药物,-,胰岛素；,Sanger,等人完成了入噬菌体,48,502bp,全序列测定。,1983,获得第一例转基因植物。,1984,斯坦福大学获得关于重组,DNA,的专利。,1986,GMO,首次在环境中释放。,1988,J.D.Watson,出任,人类基因组计划,首席科学家。,1989,DuPont,公司获得转肿瘤基因小鼠,-Oncomouse,。,1992,欧共体,35,个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。,1994,第一批基因工程西红柿在美国上市。,1996,完成了酵母基因组,(1.25107bp),全序列测定。,1997,英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。,2000,完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。,2001,完成第一个人类基因组全序列测定。,2004,中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。,2005,中、美、日科学家联合完黑猩猩基因组全序列测定。,5.1.4,基因克隆技术及其相关概念,酶简介,载体简介,细菌转化及筛选,鉴定重组子,基因克隆举例,限制性核酸内切酶,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),一类能识别和切割双链,DNA,分子中特定碱基顺序的核酸水解酶,分类,:,、,、,（基因工程技术中常用,型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；斜体,第四个字母代表菌株；,罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),即反相重复结构，是,DNA,分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。,切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,DNA,连接酶,:,通过磷酸二酯键把两个或多个,DNA,片断连接成一个整体,DNA,分子。,T,4,DNA,连接酶,E.coli-DNA,连接酶,T,7,DNA,连接酶,目的基因的来源,原核细胞,真核细胞：,cDNA,或,gDNA,文库,人工合成及,PCR,扩增目的基因,天然,DNA,（染色体,DNA,、病毒,DNA(,噬菌体,DNA),、质粒,DNA,、线粒体,DNA,和叶绿体,DNA,）,重组实验中的主要载体,定义：,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制,；,具有两个以上的,遗传标记,物，便于重组体的筛选和鉴定；,有多克隆位点,（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,。,噬菌体载体：,双链,DNA,病毒，约,50kb,两端有一个,12,个核苷酸,5,端突出粘性末端,噬菌体,噬菌体载体的特点：,1,、克隆的,DNA,有大小限制。,2,、和外源,DNA,连接后，都要经过体外包装过程，把重组的,DNA,包进头部，和尾部装配成有感染性的噬菌体。,3,、如果没有外源,DNA,插入，载体本身的,DNA,太小是不能被包装的，这样可确保转化后产生的空斑是重组体。,4,、重组的,DNA,由于利用噬菌体把它注入细胞中，因此和重组质粒,DNA,转化相比，具有高得多的转化率。,Cos,质粒载体：又叫粘粒载体（,cosmid,），是带有,cos,位点的质粒，是由,噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自,噬菌体粘性末端的,DNA,片段，即,cos,位点，其对于将,DNA,包装成,噬菌体粒子是必需的。,结构图,cos,质粒的结构,柯斯质粒载体的优点：,具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；,具有质粒,DNA,的复制方式，重组,DNA,注入宿主细胞后，两个,cos,位点连接形成环状,DNA,分子，如同质粒一样进行复制；,具有克隆大片段外源,DNA,的能力，柯斯质粒本身一般只有,57kb,左右，而它可克隆外源,DNA,片段的极度限值竟高达,45kb,，远远超过质粒载体及,噬菌体载体的克隆能力。这是其最大优点。,黏粒、,YAC,、,BAC,：,高容量载体,单个克隆载体所容纳的外原,DNA,片段的大小,质粒：,10kb,噬菌体：,23kb,黏粒：,45kb,BAC,：,350kb,YAC,：,1000kb,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,?,细菌转化,细菌转化,（,transformation,）,：,p163,感受态细胞（,Competent cells,）,：,受体细胞经过一些特殊方法（如：,CaCl,2,等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源,DNA,的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称,将异源,DNA,分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状,供体 受体,转导？转染？,受体细胞的特点：,限制缺陷型,:,避免修饰和降解,重组缺陷型：,避免重组整合,转化亲和型：,较高的可转化性,遗传互补型：,利于筛选,感染缺陷型：,防止感染,常用的转化方法：,化学转化（,CaCl,2,）法,电击法,PEG,介导转化,人工体外包装,化学转化原理：,在,0,冷冻处理时，处于,CaCl 2,低渗溶液中的大肠杆,菌细胞膨胀成球形。,DNA,可吸附于其表面。在短暂的,热冲击下，细胞吸收外源,DNA,，然后在丰富培养基内,复原并增殖，表达外源基因。,电击转化：,使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过,高压脉冲的作用将载体,DNA,分子导入受体细胞。,菌液：生长对数期,场强,(,最大转化效率,),：,12.5-15kV/cm,温度：,0-4,基因重组,转染,体外包装,噬菌体,噬菌体体外包装,3,）转化率,：,转化细胞,/,细胞总数,影响因素：,载体：,载体性质、空间结构、分子大小等,受体细胞,转化过程,克隆的筛选：,抗生素基因。,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等,-,互补蓝白斑筛选,电泳检测法,营养条件（自养、异养）,1,）抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp,平板,Tet,平板,-,互补筛选,质粒,:-,半乳糖苷酶基因（,LacZ,）的调控序列和氨基端（,N,端）,146,个氨基酸编码序列,宿主细胞,:,编码,-,半乳糖苷酶羧基端（,C,端）部分序列,添加,IPTG/X-gal,的培养基上筛选蓝白斑,蓝白斑筛选,Lac Z ,IPTG,X-gal X +gal,（白色）（蓝色）,Lac Z,（失活）,IPTG,X-gal X-gal,（白色）（白色）,蓝白斑,电泳检测法,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的,PCR,扩增片段,例,1.General process of,gene engineering,1.,从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的,DNA,片段。,2.,将带有目的基因的外源,DNA,片段和载体分别进行酶切。,4.,将重组,DNA,分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。,5.,从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组,DNA,分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。,3.,将酶切片段与具有选择记号的载体连接，形成重组,DNA,分子。,人体生长激素释放激素,(SS),抑制和调节多种激素的作用,从动物脑中提取,:,5mg-,50,万只羊脑,基因工程,9,升大肠杆菌,培养液,例,2,大肠杆菌,SS,蛋白,重组体,+,SS,基因,大肠杆菌,SS,蛋白,重组体,+,SS,基因,目的基因,基因载体,5.1,重组,DNA,技术回顾,5.2 DNA,基本操作技术,5.3 RNA,基本操作技术,5.4 SNP,的理论与应用,5.5,基因克隆技术,5.6,蛋白质组与蛋白质组学技术,5.2,DNA,基本,操作技术,5.2.1,核酸的凝胶电泳,自从琼脂糖,（,agarose,）和聚丙烯酰胺（,polyacrylamide,）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离,DNA,的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组,DNA,分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：,DNA,分型、,DNA,核,苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的,迁移率,，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。,已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。,基本原理,在生理条件下，核酸分子之糖,-,磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，,DNA,和,RNA,多核苷酸链又被称为多聚阴离子（,polyanions,），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖,-,磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，,DNA,分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。,大分子量的,DNA,移动的慢,小分子量的,DNA,移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA,加样孔,DNA Marker,及其作用,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为,0.250kb,之间,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为,1,个碱基对到,1000,个碱基对之间,凝胶类型及浓度,分离,DNA,片段的大小范围（,bp,）,0.3%,琼脂糖,50 0001 000,0.7%,琼脂糖,20 0001 000,1.4%,琼脂糖,6 000300,4.0%,聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%,聚丙烯酰胺,50025,20.0%,聚丙烯酰胺,501,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（,ethidium bromide,，简称,EtBr,）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中,DNA,的谱带部位，即使每条,DNA,带中仅含有,0.05,g,的微量,DNA,，也可以被清晰地检测出来。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的,DNA,分子发出荧光,称样,溶解,加热,制板,倒胶,电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,结果,5.2.3,聚合酶链式反应,聚合酶链式反应,(polymerase chain reaction,PCR),是一种在体外快速扩增特定基因或,DNA,序列的方法,。,PCR,最初的原始雏形概念是类似,基因修复复制,，它是于,1971,年由,Dr.Kjell Kleppe,提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似,PCR,前两个周期反应）的实验。,而现今所发展出来的,PCR,则于,1983,年由,Dr.Kary B.Mullis,提出，并于,1985,年与,Saiki,等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，,PCR,技术在生物科学研究和应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。,Mullis,也因此获得了,1993,年诺贝尔化学奖。,1.,变性,（,90-96,）,在加热或碱性条件下可使,DNA,双螺旋的氢键断裂，形成单链,DNA,，称之为变性。,2.,退火,（,25-65,）,是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段,DNA,片段。,3.,延伸,（,70-75,）,从结合在特定,DNA,模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按,53,的方向沿着模板顺序合成新的,DNA,链。,标准的,PCR,过程分为三步：,PCR,反应体系,引物,dNTP,Mg,2+,Taq,聚合酶,模板,反应缓冲液,引物设计的基本原则：,1.,引物的长度一般为,15-30 bp,，常用的是,18-27 bp,，但不应大于,38bp,，因为过长会导致其退火温度大于,74,，不适于,Taq DNA,聚合酶进行反应。,2.,引物序列,3,端出现,3,个以上的连续碱基，如,GGG,或,CCC,，也会使错误引发机率增加。,3.,引物,3,端的末位碱基对,Taq,酶的,DNA,合成效率有较大的影响。末位碱基为,A,的错配效率明显高于其他,3,个碱基，因此应当避免在引物的,3,端使用碱基,A,。另外，两条引物,3,端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致,PCR,反应失败。,4.5,端序列对,PCR,影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等,.,通常应在,5,端限制酶位点外再加,1-2,个保护碱基。,5.,引物序列的,GC,含量一般为,40-60%,，过高或过低都不利于引发反应，因为,GC,含量决定了,DNA,双链的解链温度（,T,m,）。另外，上下游引物的,GC,含量不能相差太大。,6.,一般,PCR,反应中的引物终浓度为,0.2-1.0mol/L,。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。,用,NaOH,将,pH,调至,7.0,。,dNTP,原液可配成,5-10mmol/L,并分装,-20,贮存。一般反应中每种,dNTP,的终浓度为,20-200mol/L,。,理论上,4,种,dNTP,各,20mol/L,足以在,100l,反应中合成,2.6g,的,DNA,。当,dNTP,终浓度大于,50mmol/L,时可抑制,Taq DNA,聚合酶的活性。,4,种,dNTP,的浓度应该相等,以减少合成中由于某种,dNTP,的不足出现的错误掺入。,dNTP,PCR,反应体系,-Mg,2+,Mg,2+,浓度对,Taq DNA,聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,Mg,2+,浓度过低，会显著降低酶活性,;Mg,2+,浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。,Mg,2+,浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。,通常,Mg,2+,浓度范围为,0.5-2mmol/L,1.5mM,最佳。,PCR,反应体系,-Taq,聚合酶,扩增效率最高,1000 bp/min,活性,5-3 DNA,聚合酶活性强无,3-5 DNA,外切酶活性,错配率每个循环约,1/6000 3,末端加“,A”,产物可直接进行“,TA”,克隆,pfu,酶,保真度高,原理,:,具,3,5,核酸外切酶活性，即校正功能。效率相对较低,500 bp/min,3,末端不加“,A”,，加,A,后才可进行,TA,克隆。,就模板,DNA,而言,影响,PCR,的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板浓度为,50-100 ng/ml,。,模板量过多则可能增加非特异性产物。,DNA,中的杂质也会影响,PCR,的效率,.,PCR,反应体系,-,模板,DNA,PCR,反应体系,PCR,反应缓冲液,缓冲液一般含,10-50mmol/L TrisCl(20,下,pH8.3-8.8),50mmol/L KCl,和适当浓度的,Mg,2+,.,另外，反应液可加入,5mmol/L,的二硫苏糖醇,(DDT),或,100g/ml,的牛血清白蛋白,(BSA),它们可稳定酶活性。,PCR,反应参数,:,变性,在第一轮循环前,在,94,下变性,3-5min,非常重要，它可使模板,DNA,完全解链。变性不完全，往往使,PCR,失败，因为未变性完全的,DNA,双链会很快复性，减少,DNA,产量。,对于富含,GC,的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,PCR,反应参数,:,退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的,Tm,值约低,5,，时间一般为,20-60s,。,PCR,反应参数,:,延伸,延伸反应通常为,72,，接近于,Taq DNA,聚合酶的最适反应温度,75,。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为,Taq DNA,聚合酶的作用温度范围可从,20-85,。,一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间,(5-10 min),的延伸反应。,以获得尽可能完整的产物,，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,PCR,反应参数,:,循环次数,当其它参数确定之后，循环次数主要取决于,DNA,浓度。一般而言,25-30,轮循环已经足够。循环次数过多，会使,PCR,产物中非特异性产物大量增加。,如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的,DNA,样品稀释,10,3,-10,5,倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经,60,轮循环后，扩增水平可达,10,9,-10,10,。,PCR,反应程序,:,温度（,）,时间（,min,）,94,72,60,94,变性（,0.5min,）,60,退火（,0.5min,）,72,延伸,（,1min,）,循环,1,循环,2,循环,3,94,预,变性（,5min,）,PCR,技术在基因克隆方面的应用,（,1,）目的基因的直接克隆，,（,2,）通过,RT-PCR,进行,cDNA,的克隆；,（,3,）制备,DNA,探针，进行分子检测等。,5.2.4.,实时定量,PCR,一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，,PCR,产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。,实时荧光定量,pcr,技术中的一些重要因素：,Ct,值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,Ct,值与起始模板的关系，每个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,Ct,值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。,实时荧光定量,PCR,中荧光化学，荧光定量,pcr,所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：,TaqMan,荧光探针,：,PCR,扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；,PCR,扩增时，,Taq,酶的,5,3,外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条,DNA,链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与,PCR,产物形成完全同步。,SYBR,荧光染料,：在,PCR,反应体系中，加入过量,SYBR,荧光染料，,SYBR,荧光染料特异性地掺入,DNA,双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的,SYBR,染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与,PCR,产物的增加完全同步。,TaqMan,荧光探针,SYBR,荧光染料,在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（,clone,）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（,monozygotic twins,）便是属于同一克隆。,在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（,progenitor cell,）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。,在分子生物学上，人们把将外源,DNA,插入具有复制能力的载体,DNA,中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,5.2.5,基因克隆技术,分子克隆的主要方法,（,1,）,构建,cDNA,、核,DNA,文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；,（,2,）差式杂交,(differential screen),和扣除杂交,(subtractive hybridization),技术；（,3,）,DD-RT-PCR,法及差别显示技术；,（,4,）,RACE,技术,（,5,）酵母双杂交体系,Two-hybrid system,；,（,6,）图位克隆法（,map-based cloning,）与染色体步移（,genomic DNA Walking,）。,1,目的基因的获取,需要克隆的,DNA,片段：,化学合成法,cDNA,文库,基因组,DNA,文库,聚合酶链式反应,1,）化学合成法：,较短的基因（,60-80bp,）,用途：,PCR,引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,2,）基因文库,限制性内切酶,克隆、转化、培养、,鉴定,基因组,DNA,基因文库,DNA libraries,DNA libraries,are sets of DNA clones,each of which has been derived from the insertion of a different fragment into a vector followed by propagation in the host.,A clone,is a genetically distinct individual or set of identical individuals,Genomic,DNA,libraries,CDNA libraries,Genomic libraries,prepared form random fragments of genomic DNA,which may be inefficient to find a gene because of the huge abundance of the non-coding DNA,3,）,基因组,DNA,文库的构建,从生物组织细胞提取出全部,DNA,将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组,DNA,片段与载体连接的重组,DNA,分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各,DNA,片段克隆的集合体，就称为基因组,DNA,文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组,DNA,全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。,基因组,DNA,文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。,基因组,DNA,文库,限制性内切酶,基因组,DNA,基因与载体重组,转化细菌,体外包装,基因组,DNA,文库的构建过程,5.1,重组,DNA,技术回顾,5.2 DNA,基本操作技术,5.3 RNA,基本操作技术,5.4 SNP,的理论与应用,5.5,基因克隆技术,5.6,蛋白质组与蛋白质组学技术,5.3 RNA,基本操作技术,5.3.1,总,RNA,的提取,RNA,易遭降解，实验要求较严格。总,RNA,提取的方法有多种，主要有,LiCl法,、,CTAB法,、,异硫氰酸胍法,（,TriZol,）。,异硫氰酸胍法,（,TriZol,）原理：,TRIZOL,试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使,RNA,与蛋白质分离，并将,RNA,释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使,RNA,进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样,RNA,与仍留在有机相中的蛋白质和,DNA,分离开。水相层（无色）主要为,RNA,，有机层（黄色）主要为,DNA,和蛋白质。,5.3.2,mRNA,的纯化,mRNA,的分离方法较多，其中以寡聚（,dT,）,-,纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。,利用,mRNA,的,Poly A,结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚,dT,引物，与,Poly A,杂交，形成生物素化寡聚,dT-mRNA,的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素,-,顺磁颗粒（,SA-PMPs,）结合杂交体，形成生物素化寡聚,dT-mRNA-SA-PMPs,复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的,SA-PMPs,颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚,dT,引物与,mRNA,分离，从而纯化得到,mRNA,。,PolyATtract mRNA,的分离纯化过程简图,5.3.3 cDNA,的合成,cDNA,的合成包括第一链和第二链,cDNA,的合成。第一链,cDNA,的合成是以,mRNA,为模板，反转录为,cDNA,，有反转录酶催化，该酶合成,DNA,时需要引物引导，常用引物是,oligo dT,。第二链合成是以第一链为模板，由,DNA,聚合酶催化。,mRNA,ss,cDNA,ds,cDNA,ds,cDNA,反转录酶,DNA,聚合酶,I,或,Klenow,片断,反转录酶,核酸酶,S1,cDNA libraries,DNA copies(cDNA)synthesized from the mRNA by reverse transcription are inserted into a vector to form a cDNA library.Much more efficient