PCR原理及特点--检验科.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离,克隆,，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,概念,目 录,PCR技术简史,PCR的原理,PCR的反应五要素,PCR的反应条件的选择,PCR的应用,PCR的最早设想,核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，,Korana,于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可,克隆,tRNA基因”。,PCR技术简史,PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现(DNA polymerase I),而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E.Coli 则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow 所发现,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素(简称 Taq polymerase),则是于1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制(DNA repair replication)，它是于1971年由 Dr.Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr.Kary B.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于一家物科技研究公司(Perkin-Elmer Cetus Corporation).目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年，Science 将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子(Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。,1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,此酶具有以下,特点：,耐高温,，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。,在热变性时不会被钝化,，不必在每次扩增反应后再加新酶。,大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：,1.变性,(denaturation),：,：,高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）,2.退火,(annealling),：,低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）,3.延伸,(extension),：,中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 （7072，3060s）,。,PCR技术的基本原理,加热,变 性,复性,复温,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量的计算：,Y(1X)n,Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。,平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。,PCR的反应动力学,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物,的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性,增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。,大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液10,l4种dNTP混合物各200,mol/L引物10100pmol模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100,l,PCR反应五要素,1.引物,（primer）,2.酶,（Taq DNA polymerase）,3.dNTP,（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）,4.模板,（template）,5.Mg,2+,（magnesium）,1.引物,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,引物长度：,15-30bp，常用为20bp左右；,引物扩增跨度：,以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；,引物碱基：,G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；,避免引物内部出现二级结构：,避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；,引物3端的碱基应严格要求配对：,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；,引物中有或能加上合适的酶切位点,，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；,引物的特异性：,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；,引物设计的原则,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：,天然酶：,从栖热水生杆菌中提纯,基因工程酶：,大肠菌合成,一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100l时）；,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,2.酶及其浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：,dNTP呈颗粒状,，保存不当易变性失活,dNTP溶液呈酸性,，使用时应小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解,在PCR反应中,，dNTP应为50200umol/L，尤其是,注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或,偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR,产物的产量,dNTP 能与Mg2+结合,，使游离的Mg2+浓度降低,3.dNTP的质量与浓度,4.模板（靶基因，target gene）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；,传统DNA纯化方法：,采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本；,SDS,：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细,胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；,蛋白酶K,能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有,机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇,沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。,临床检测标本,：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增；,RNA模板提取：,采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,5.Mg,2+,浓度,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂，,对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响;,Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,在一般的 PCR反应中，dNTP浓度为200mol/L时，Mg,2+,浓度为1.52.0 mmol/L为宜;,PCR反应条件的选择,温度/时间/循环次数,1.温度与时间的设置,变性-退火-延伸三个温度点,标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸,二温度点法,对于较短靶基因（长度为100300bp时），将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因,一般9394 1min足以使模板DNA变性,若低于93则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素；,变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞；,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度；,对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。,退火(复性)温度与时间,复性温度=Tm值（解链温度）-（510）,在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性,复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,引物的复性温度,延伸温度：一般选择在7075之间,常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,高于90时，DNA合成几乎不能进行,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）,34kb的靶序列需34min,扩增10Kb需延伸至15min,延伸进间过长会导致非特异性扩增，对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,延伸温度与时间：,2.循环次数,决定PCR扩增程度;,主要取决于模板DNA的浓度;,选在3040次之间，循环次数越多，非特异性,产物的量亦随之增多,PCR反应特点,特异性强,灵敏度高,简便、快速,对标本的纯度要求低,1.特异性强,关键：引物与模板的正确结合,引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的,合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高,2.灵敏度高,PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10,-12,)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10,-6,)水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞,在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU(空斑形成单位),细菌检测的最小检出率为3个细菌,3.简便、快速,PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，进行变性-退火-延伸反应，一般在2-4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,4.对标本的纯度要求低,不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板,可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,PCR的应用,谢谢大家！,