生物技术与食品产业.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 基因工程与食品科学,概述,基因工程定义,是指按人们需要，用类似工程设计方法将不一样起源基因（,DNA,分子），在体外构建杂种,DNA,分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表示操作。又称为,DNA,重组技术。,基因工程实施包含四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体,1/111,基因工程内容和方法,主要内容：,分离制取带有目标基因,DNA,片段；在体外，将目标基因连接到行当载体上；将重组,DNA,分子导入受体细胞并扩增繁殖；从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组,DNA,分子重组体；外源基因表示和产物分离和纯化。,2/111,主要方法,密度梯度离心；,DNA,分子切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、,DNA,序列结构分析以及人工合成、基因定点突变和,PCR,扩增等各种新技术、新方法。,3/111,基因工程分子生物学基础,脱氧核糖核酸,DNA,变性、复性和杂交,DNA,复制,DNA,修复,生物基因重组,基因,遗传信息传递方向,4/111,脱氧核糖核酸,生物遗传物质是,DNA,。,DNA,是由大量脱氧核糖核苷酸组成线状或环状生物大分子。由碱基、磷酸、戊糖组成。碱基由腺嘌噙（,A,）、鸟嘌噙（,G,）、胞嘧啶（,C,）与胸腺嘧啶（,T,）组成。,5/111,DNA,变性、复性与杂交,DNA,变性（,DNA denaturation,）：在高温及强碱长久保持下，双链,DNA,分子氢键断裂，两条链完全分离，形成单,DNA,分子。,复性（,renaturation,）或退火,(annealing),：变性,DNA,分子经处理又可重新形整天然,DNA,分子，这个过程称。降低温度、,pH,及增加盐浓度均可促进,DNA,复性。,杂交（,hybridization,）,:,当复性,DNA,分子由不一样两条链分子形成时，这种复性称为。,6/111,DNA,复制,复制是一个复杂过程，可参看相关书籍。,DNA,复制特点：从特定开始并按特定方向进行（,5,3,）；,DNA,分子复性是半保留复制；,DNA,分子复制是半不连续复制；,DNA,分子复制是经过,DNA,聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子协同有序工作完成；,DNA,分子复制含有高度准确性和准确性,DNA,分子复制速度：细菌：,10,4,10,5,核苷酸,/min,，而在真核细胞中为,5005000,核苷酸,/min,7/111,DNA,修复,DNA,复制时可能因为,DNA,聚合酶引发偶然错误，或者因为环境原因致使,DNA,产生序列上错误，此时生物体内存在着修复系统就会对,DNA,变异起保护修复作用。,DNA,修复主要包含三个步骤：,DNA,修复核酸酶对,DNA,双链上不正常碱基识别与切割；,DNA,聚合酶对已切割区域重新合成；,DNA,连接酶对剩下切口修补,8/111,基因,基因是含有遗传疚,DNA,片段，也是编码蛋白质或,RNA,分子遗传信息基本遗传单位。,.2.12,由美、中、日、英、法等国宣告人类基因组草图完成，人类基因组由,31.67,亿个碱基组成，共有,3,万个左右基因,当代研究表明：基因是一个功效单位，但不是一个不可分割最小重组单位和突变单位，它包含若干个空谈子和重组子。,9/111,移动基因（,movable gene,）：是指一个或以从染色体基因组上一个位置转移到另一个位置，甚至在不一样染色体之间跃迁，故也称为跳跃基因。但这种移动只是移动一个拷贝，在原来位置还保留一份拷贝。,断裂基因（,split gene;interrupted gene,）：基因编码序列中有与氨基酸编码无关,DNA,间隔序列，使一个基因分隔成不连续若干区段。这种编码序列不连续间断基因称为。,10/111,断裂基因表示程序是：先转录成初级转录物，又叫前体,mRNA,，然后经过删除和连接，除去无关,DNA,间隔序列转录物，便形成了成熟,mRNA,分子；它从细胞核中输送到细胞质，再译成对应有多肽链。其中被剪除,DNA,部分叫间隔序列或内含子（,intron,），被保留下来,DNA,部分叫编码序列或外显子（,exon,）。这种内含子除和外显子连接，形成成熟,mRNA,过程，称为,RNA,剪接。,11/111,假基因（,pseudo gene,）在真核生物中普遍存在。这是一类在基因中稳定存在，核苷酸序列同其对应正常功效基因基本相同、但却不能合成出有功效蛋白质失活基因，它是对应正常基因空谈而丧失活性结果。人类基因中与蛋白质合成相关基因只占整个人类基因组,2%,。,12/111,重复序列（repeated sequence）：是指在一个DNA分子中出现不止一次序列。几乎全部真核生物基因组DNA中都有重复序列。在人类基因组计划中发觉，35.3%基因组包含重复序列。,13/111,重合基因（overlapping gene）：是指一个基因序列中，含有另一个基因部分或全部序列，即其核苷酸序列是重合。基因重合现象仅发觉于一些噬菌和病毒基因组中。,14/111,中心法则,转录 翻译,DNA RNA,蛋白质,反转录,15/111,基 因 重 组,目标基因与载体基因，标识基因等连接叫基因重组,重组质粒基因包含：,标识片段,开启子,目标基因,终止子,载 体 基 因 片 段,16/111,基因工程普通操作步骤,目标基因取得 载体选择,重组质粒构建,导入目标生物体细胞内,转基因重组体取得,转基因生物判定,17/111,基 因 工 程 特 点,生物基因能够在人类、动物、植物和微生物四大系统间进行交流,能够大大缩短育种年限。,变异能够定向,18/111,基因工程基本原理和内容,一、基本概念,染色体,DNA,（脱氧核糖核酸）,RNA,（核糖核酸）,基因,中心法则,19/111,20/111,1、DNA分子是由两条相互平行脱氧核苷酸长链盘绕而成。2、DNA分子中脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，组成基本骨架，碱基排列在内侧。3、两条链上碱基经过氢键相结合，形成碱基对，它组成有一定规律。,21/111,人类染色体组示意图,22/111,细胞核示意图,23/111,动物细胞示意图,24/111,植物细胞示意图,25/111,DNA,（脱氧核糖核酸）,由两条极性相反并互补多聚核苷酸链围绕中心轴双螺旋结构。,两条链中碱基之间按照,A,配,T,G,配,C,互补标准，以氢键连接。,其中,A,为：腺嘌呤,T,为：胸腺嘧啶,G,为：鸟嘌呤,C,为：胞嘧啶,U,为：尿嘧啶,(RNA),DNA,直线排列于染色体上，存在于细胞核中。,DNA,有自我复制能力。,26/111,DNA,自我复制示意图,27/111,DNA,双螺旋碱基配对图,28/111,RNA,（,核糖核酸）,存在于细胞质中,分别有三种功效不一样,RNA,rRNA tRNA rRNA,mRNA,为遗传密码，由,DNA,转录而来,29/111,相关基因概念,基因是含有一定功效,DNA,片段，是遗传基本单位。,获取某段有一定生理功效,DNA,片段叫基因克隆。,找出某段有一定生理功效,DNA,片段在染色体上位置叫基因定位。,测定出某段有一定生理功效,DNA,片段碱基序列叫基因测序。,按照一定碱基序列，以核苷酸为原料，合成某段有一定生理功效,DNA,片段叫基因合成。,30/111,基因工程研究对象,硕士物大分子，如：蛋白质、核酸、多糖等调整生命过程物质，包含它们结构、性状、代谢。,分子生物学是基因工程基础。,31/111,工具酶,三大类：,限制性内切酶,连接酶,修饰酶,32/111,Restriction enzymes(,recognize specific short sequences of DNA and cleave the duplex(sometimes at target site,sometimes elsewhere,depending on type).,识别序列常是一组含,4-6,个核苷酸回文序列,.,是一类能识别和切割双链,DNA,分子中某特定核苷核酸序列酶,Restriction map,is a linear array of sites on DNA cleaved by various restriction enzymes.DNA,限制酶切片段沿染色体或染色体片段依次排列称作限制图谱,.,33/111,限制性核酸内切酶命名,按酶起源属、种名而定，取属名第一个字母,大写,与种名头两个字母,小写,组成三个,斜体字母,作略语表示；,如有株名，再加上一个字母；,其后用大写罗马数码,、,、,区分同菌株种内含有不一样限制性修饰系统。,比如：从流感,嗜血杆菌,d,株（,H,aemophilus,in,fluenzae,d,）中先后分离到,3,种限制酶，则分别命名为,Hin,d,、,Hin,d,和,Hin,dIII,。,Bam,H,Cla,I,Eco,R,Hin,d III,34/111,限制性核酸内切酶,（,restriction endonuclease,）,识别,DNA,特异序列，并在识别位,点或其周围切割双链,DNA,一类内切酶。,是细菌内存在保护性酶。分为,I,、,II,、,III,三类。,限制性核酸内切酶分类,35/111,I,II,III,DNA,底物,双链,DNA,双链,DNA,双链,DNA,辅因子,Mg,+,ATP,SAM,Mg,+,Mg,+,ATP,识别序列,特异(识别和结合于特定DNA序列位点),特异,特异,识别点对称,否,回文序列,否,切割位点,随机切断在识别位点以外DNA序列，通常在识别位点周围400-1000bp,识别位点范围内或它近端处固定位点,在识别序列周围,25-30bp,范围内,固定位点,甲基化功效,有,无,有,(ATP,：腺嘌呤核苷三磷酸,;SAM,：,S,腺苷酰甲硫氨酸,),是分子生物学中应用最广限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到限制性核酸内切酶主要指类酶而言。,II,类酶识别序列特点为,回文结构,。,GGATCC ,CCTAGG ,36/111,三、限制性内切酶切割位点,大部分限制性核酸内切酶识别,DNA,序列含有回文结构特征，切断双链,DNA,都产生,5,磷酸基和,3,羟基末端。不一样限制性核酸内切酶识别和切割特异性不一样,37/111,EcoR 1 from,E.coli,G A A T T C,C T T A A G,PALINDROME,palindrome,A A G C T T,Hind III,from,T T C G A A,Haemophilus influenza,38/111,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：,钝性末端,(blunt end/flush end),粘性末端,(sticky end/cohesive end),39/111,5,-,端突出,粘性末端,3,-,端突出,限制性核酸内切酶识别序列长度为,48,个,bp,。,不一样酶切产生相同粘性末端称,配伍末端,（,compatible end,），可用连接酶连接。,40/111,A B C,41/111,Restriction Nucleases,42/111,Restriction Nucleases,43/111,不一样有限制性核酸内切酶识别,DNA,序列能够不相同。有识别四核苷酸序列，有识别六或八核苷酸序列。,假如,DNA,中核苷酸序列是随机排列，则一个识别四核苷酸序列内切酶平均每隔,256bp,（,4,4,）出现一次该酶识别切割位点，一样对识别六或八核苷酸序列内切酶则大致上分别是每隔,4096bp(4,6,),或,65,536bp(4,8,),出现一次识别切割位点。按此可大致预计一个未知,DNA,分子限制性内切酶可能含有切点频率，方便选取适当内切酶。,限制性核酸内切酶种类很多，至今已发觉近,800,各种，能够依据它们对,DNA,有不一样识别序列和切割特征选取，从而为基因工程提供了有力工具。表列出了几个最惯用限制性核酸内切酶识别序列和切割点。,44/111,几个最惯用限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶名称,识别序列和切割点,BamH,Cla,EcoR,Hind,Hind,Kpn,Not,Pst,Sal,Sau3A,Sfi,Sma,Xba,Xho,GGATCC,ATCGAT,GAATTC,AAGCTT,GTPyPuAC,GGTACC,GCGGCCGC,CTGCAG,GTCGAC,GATC,GGCCNNNNNGGCC,CCCGGG,TCTAGA,CTCGAG,45/111,同裂酶（,isoschizomers,）,:,有一些起源不一样限制酶识别是一样核苷酸靶位点序列，这类酶称为同裂酶。,/,异源同工酶,也用于分析甲基化,HpaII,和,MspI,均识别,CCGG,，其中*表示甲基化。甲基化后,HpaII,不可切，而,MspI,能够。,同尾酶（,isocaudamer,）,:,一些起源不一样限制酶，识别是不一样核苷酸靶位点序列，不过产生相同粘性末端。这类没酶称为同尾酶。,如,BamH I GGATCC,Bcl I TGATCA,Bgl II AGATCT,Xho II UGATCY U,嘌呤,Y,嘧啶,几个相关概念,*,46/111,限制性内切酶,是一类能识别和切割双链,DNA,分子中某特定核苷核酸序列酶,47/111,限制性内切酶类型及其特征,主要特征,酶蛋白组成,三种不一样亚基,两个相同亚基,两种不一样亚基,酶活辅助因子,ATP,、,Mg,2+,、,S-,腺苷甲硫氨酸,Mg,2+,ATP,、,Mg,2+,识别序列特征,EcoB:TGAN,8,TGCT,EcoK:AACN,6,GTGC,旋转对称,EcoP:AGACC,EcoP,15,:CAGCAG,切割位点,距特异识别位点最少1000bp处随机切割,在特异识别位点上或其附近特异切割,距特异识别位点,3,端,2426bp,处特异切割,基因工程中不用,基因工程中惯用,基因工程中不用,48/111,49/111,Figure 2.1 DNA can be cleaved by restriction enzymes into fragments that can be separated by gel electrophoresis.,50/111,Figure 2.2 Double digests define the cleavage positions of one enzyme with regard to the other.,51/111,Figure 2.3 A restriction map can be constructed by relating the A-fragments and B-fragments through the overlaps seen with double digest fragments,.,52/111,Figure 2.5 A restriction map is a linear sequence of sites separated by defined distances on DNA.The map identifies the sites cleaved by enzymes A and B,as defined by the individual fragments produced by the single and double digests.,Genes can be mapped by restriction cleavage,53/111,Four alleles for a restriction marker are found in all possible pairwise combinations,and segregate independently at each generation.Photograph kindly provided by Ray White.,54/111,Figure 2.6A point mutation that affects a restriction site is detected by a difference in restriction fragments.,How variable are individual genomes?,55/111,Figure 2.9 If,a restriction marker,is associated with a,phenotypic,characteristic,the restriction site must be located near the gene responsible for the phenotype.,The mutation changing the band that is common in normal people into the band that is common in patients is very closely linked to the disease gene.,56/111,其它主要酶,一、核酸酶,Nuclease*,1.,外切酶,exounclease,2.,内切酶,endonuclease,二、连接酶,(Ligase),三、聚合酶,polymerase,四、,DNA,修饰酶,modifying enzyme,1.,碱性磷酸酶,2.,寡核苷酸激酶,3.,末端脱氧核苷酸转移酶,五、拓特异构酶,57/111,核酸酶,(nucleases),是指全部能够,水解核酸酶。,按底物不一样分为：,DNA,酶（,DNase,）*,RNA,酶（,RNase,）,一、核酸酶 Nuclease*,58/111,按作用部位不一样分为：,5,末端外切酶,核酸外切酶,3,末端外切酶,核酸内切酶,限制性核酸内切酶：*,有严格序列依赖性，是基因工,程中主要工具酶。,59/111,核酸外切酶（,exonuclease,）是从核酸一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；,核酸内切酶,(endonuclease),则从核酸链中间水解,3,，,5,磷酸二酯键，将核酸链切断。,很多细菌和细胞中都能识别外来核酸并将其分解，,1962,年发觉这是因为细菌中含有特异核酸内切酶,能识别特定核酸序列而将核酸切断,;,同时又伴随有特定核酸修饰酶,最常见是甲基化酶,能使细胞本身核酸特定序列上碱基甲基化,从而防止受内切酶水解,外来核酸没有这种特异甲基化修饰,就会被细胞核酸酶所水解,.,这么细胞就组成了,限制,-,修饰体系,其功效就是保护本身,DNA,分解外来,DNA,以保护和维持本身遗传信息稳定,这对细菌生存和繁衍含有主要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念由来。,60/111,61/111,核酸外切酶,exonuclease(E.coli),只从一条,DNA,3,端外切,DNase I,对双链和单链,DNA,都进行剪切，在双链,DNA,上产生随机切口,RNaseH,特异性降解,RNA-DNA,杂交分子中,RNA,链，,cDNA,中二链合成,单链核酸内切酶,BAL31,攻击,5,和,3,核苷酸。双链外切活性与单链内切活性,S1 endonuclease(tungus Aspergillus oryzae),只攻击单链,DNA,，包含双链中单链,62/111,二、连接酶,(Ligase),将核酸分接在一起，需要,ATP,供能。,1,）封闭作用,2,）连接两个分子,63/111,连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻,DNA,链连接成完整链。反应需要,ATP,。,四、,DNA,连接酶,（,DNA ligase,）,ATP,64/111,DNA,连接酶在,复制、,DNA,修复、,重组、剪接,中均起,缝合缺口,作用。,是主要,工具酶,之一。,65/111,C T T A A,G,G,AATTC,plasmid,Isolated gene,Add DNA ligase,C T T A A,G,G,A A T T C,Recombinant DNA,Cut DNA with same restriction enzyme,66/111,DNA Ligase,67/111,Insert DNA Fragment into a vector,68/111,三、聚合酶 polymerase,复制合成新,DNA,链，合成方向,53,端。多数聚合酶都有,35,外切酶活性，每次以切除一个核苷酸速度，在无,dNTP,存在情况下，能够对单链或双链,3OH,端作用，但在,dNTP,情况下，对于双链,DNA,聚合活性将抑制外切酶活性。,对于一些,DNA,聚合酶如,E.coli.DNA polymerase,，也有,53,外切酶活性，一次能够切出一个至,10,个核苷酸。这个外切酶活性是发生在合成之前即前面切除，后面马上又合成，这反应就是缺口平移,(nick translation),53,外切活性位于分子,N,端，能够经过蛋白酶或缺失基因而除去。结果剩下聚合酶保留了合成和,35,外切酶活性，它就是,Klenow fragment(,或全称为,E.coli DNA pol large fragment),。,这些都是,DNADependent DNA polynerase,。,假如是,RNA Dependent DNA polyneraseReverse transcriptase,鸟类骨髓母细胞瘤病毒（,AMV,）,T4 DNA polymerse,单个多肽分子,112,1000,，对单链和双链有,很强,35,外切酶活性并缺乏,53,外切活性。它与,Klenow,都能够将双链突出端,DNA,转变成钝端，但功效不一样，能够标识平端甚至,3,突出。,69/111,DNA,聚合酶,催化,dNTP,聚合到核酸链上酶。是,DNA,复制主要酶。,全称叫依赖,DNA,DNA,聚合酶（,DNA,dependent DNA polymerase,）或,DNA,指,导,DNA,聚合酶（,DNA-directed DNA,polymerase,），均缩写为,DDDP,。,70/111,(,一,)DNA,聚合酶催化反应,1.,5,至,3,聚合活性,催化四种,dNTP,一个一个地接到,DNA,链上去。,(dNMP),n,+dNTP (dNMP),n+1,+PPi,71/111,聚合反应机理：,72/111,聚合反应特点：,(1),以单链,DNA,为模板,(2),以,dNTP,为原料,(3),引物提供,3-OH,(4),聚合方向为,53,73/111,2,.,核酸外切酶活性,35,外切酶活性：,切除错配核苷酸,53,外切酶活性：,切除引物切除突变片段,？,74/111,pol-I,pol-II,pol-III,53,聚合酶活性,+,+,+,35,外切酶活性,+,+,+,53,外切酶活性,+,+,功 能,切除引物,填补空隙,修复合成,不清,复制主要酶,(,二,)DNA,聚合酶种类,1.,原核生物,DNA,聚合酶,75/111,DNA-pol,I,:,单一肽链大分子,曾被称为复制酶,(replicase),含量最多,可被水解成,两个片段,小片段,(N,端,),：含有,53,外切酶活性；,大片段,(C,端,),：含有聚合活性和,35,外切酶活性，也称为,Klenow,片段,，是惯用工具酶。,76/111,DNA-pol III:,由,10,种亚基组成不对称聚合体,催化效率最高,77/111,2.,真核生物,DNA,聚合酶,DNA-pol,复制中延长随从链,DNA-pol,没有其它,pol,时才起作用,DNA-pol,催化线粒体,DNA,复制,DNA-pol,复制中延长领头链,DNA-pol,校读、修复和填补缺口,78/111,(,三,),复制保真性,(fidelity),最少依赖三种机制：,1.,恪守严格碱基配对规律；,2.,聚合酶在复制延长中对碱基选择功效；,3.,复制中即时校读功效。,79/111,POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR),DNA to be copied,A C G T nucleotides,DNA polymerase,primer sequence,Taq DNA,聚合酶，耐高温酶,80/111,四、,DNA,修饰酶,modifying enzyme,1.,碱性磷酸酶,Alkaline phosphatase(E.coli,或,calf intastinal tissue),将,DNA,分子,5-terninus,磷酸基团移去。,2.,多核苷酸激酶,polynucleotide kinase(E.coli infected with T4 phage),与碱性磷酸酶功效相反，即将磷酸基团加到,5,自由端。,3.,末端脱氧核苷酸转移酶,Terminal deoxyyaucleotidyl transferase(calf thynustissue),在,DNA,分子,3,端加上一个或多个脱氧核苷酸，即能够作用于单链也能够是双链。不需要模板。（可用于标识及连接）,81/111,五、拓特异构酶,属于解旋解链酶类,解开并理顺,DNA,双链，维持,DNA,处于单链状态。主要有解螺旋酶、,DNA,拓扑异构酶和单链,DNA,结合蛋白。,82/111,(,一,),解螺旋酶,(helicase),:,模板对复制指导作用在于碱基准确,配对，而碱基却埋在双螺旋内部。只有把,DNA,解开成单链，它才能起模板作用。,解螺旋酶是最早发觉与复制相关蛋,白质，当初称为,rep,蛋白。作用是,利用,ATP,供,能，解开,DNA,双链。,83/111,复制相关蛋白基因：,dna A,、,dna B,、,dna C dna X,对应表示产物蛋白质：,Dna A,、,Dna B,、,Dna C Dna X,Dna A,：识别复制起始位点,Dna B,：解螺旋酶,Dna C,：辅助解螺旋酶使其在起始点上,结 合并打开双链。,84/111,(,二,),单链,DNA,结合蛋白,(SSB),:,SSB,曾被称为螺旋反稳定蛋白（,HDP,）。在大肠杆菌，它是由,177,个氨基酸残基组成,同四聚体，结合单链,DNA,跨度约,32,个核苷,酸单位。,SSB,与解开,DNA,单链紧密结合，预防,重新形成双链，并免受核酸酶降解。,在复制,中维持模板处于单链状态。,85/111,(,三,)DNA,拓扑异构酶,(topoisomerase),:,拓扑,：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变性质。,拓扑异构酶,：是一类可改变,DNA,拓扑性质酶。对,DNA,分子作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。,可松弛,DNA,超螺旋，有利于,DNA,解链。,共价闭环,DNA,形成或解除超螺旋,covalently-closed-circular DNA,86/111,87/111,拓扑异构酶,I,（,topo I,）,:,在原核生物曾被称为,蛋白。,主要作用是切开,DNA,双链中一股，使,DNA,解链旋转中不打结，,DNA,变为松弛,状态再封闭切口。,88/111,拓扑异构酶,II,（,topo II,）,:,在原核生物又叫旋转酶,(gyrase),。,能切断,DNA,双链，使螺旋松弛。在,ATP,参,与下，松弛,DNA,进入负超螺旋，再连接,断端。,89/111,90/111,限制性内切酶应用,酶切图谱；,基因克隆；,RFLPs;,基因组作图,91/111,酶切图谱,限制性图谱,restriction map,定义：描述,DNA,上限制性内切酶切割位点之间距离和次序图谱。,92/111,Restriction Mapping,Map the order of genes.,Use different restriction enzymes individually on same DNA,Then use both enzymes together.,Run all 3 samples in 3 lanes of a gel.,Match up the pieces by size.,Order is revealed.,93/111,Example of R.Mapping,Use 2 enzymes,EcoRI and BamHI,EcoRI,fragments are 850,500,and 300 bp,BamHI,950,600,100 bp,Both EcoRI and BamHI,600,400,300,250,100 bp,94/111,Restriction Mapping,EcoRI BamHI Both,950,850,600,500,400,300,250,100,95/111,The Map,100 950 600,500 300850,100 400 300 250 600,BamHI,EcoRI,Both Enzymes,96/111,The Map,The 600 and 100 bp fragments are created by no EcoRI cut sites within the BamHI restriction sites.,The 300 bp fragment is created by EcoRI.,The 100 and 400 bp in double digest make up the 500 bp of EcoRI digest.,The 600 and 250 bp in double digest make up the 850 bp of EcoRI digest.,The 400,300 and 250 bp in double digest make up the 950 bp of BamHI digest.,97/111,基因克隆,98/111,99/111,100/111,101/111,限制性片段长度多态性,restriction fragment length polymorphism(RFLP),定义：特殊限制酶切割不一样个体出现得,DNA,片段大小不一样差异。造成,RFLP,多态性序列在物理图谱和遗传连锁图上被用做标识。,RFLP,通常是因切割位点发生突变所致。,102/111,Restriction Analysis,Restriction site creates fragment closely linked to gene of interest.,Restriction sites,Disease-causing allele,Normal allele,103/111,Restriction Analysis,Disease Normal,Disease Marker,104/111,Restriction Analysis,Disease resistance in oat,105/111,DNA Fingerprinting:Process,Homologous chromosomes,maternal,paternal,VNTR,1.Digest with restriction enzyme,Restriction fragments of different size(RFLPs-restriction fragment length polymorphism),2.Gel electrophoresis,106/111,Electrophoresis,maternal,paternal,gel,electrophoresis,107/111,108/111,基因组作图,基因图谱,gene mapping,定义：确定染色体上基因相对位置和基因之间距离。,图谱,mapping,定义：依据推断,DNA,图谱过程，能够构建三种类型,DNA,图谱：物理图谱，遗传图谱和细胞发生图谱，三者之间关键区分是它们基本标志不一样。,109/111,DNA-Genes-Chromosomes,110/111,DNA,重组技术中最惯用工具酶,酶,主要用途,限制性核酸内切酶,识别,DNA,特定序列，切断,DNA,链,DNA,聚合酶,或其大片段（,Klenow,）,缺口平移制作标识DNA探针 合成cDNA第二链 填补双链DNA3凹端 DNA序列分析,耐热,DNA,聚合酶（,Taq DNA,聚合酶等）,聚合酶链反应（,PCR,）,DNA,连接酶,连接两个,DNA,分子或片段,多核苷酸激酶,催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标识探针,末端转移酶,在,3,末端加入同质多聚物尾,SI,核酸酶，绿豆核酸酶,降解单链,DNA,或,RNA,，使双链,DNA,突出端变为平端,DNA,端酶,降解,DNA,，在双链,DNA,上产生随机切口,RNA,酶,A,降解除,RNA,反转录酶,cDNA,合成,磷酸酶,切除核酸末端磷酸基,111/111,