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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 生物化学检验惯用技术,1/66,掌握分光光度技术、离子选择性电极分析技术、干化学分析技术、电泳分析技术基本原理,熟悉生化常规检验仪器使用方法，及其影响原因和相关注意事项,了解各种生化惯用技术临床应用，关注生物化学检验惯用技术发展趋势,学习目标：,2/66,第一节 光谱分析技术,利用物质含有吸收、发射或散射光谱谱系特点，对物质进行定性或定量分析技术,光谱分析技术,灵敏、准确,选择性强,快速、简便,应用范围广,生物化学检验中,最基本,和最惯用,分析技术,3/66,光谱分析技术分类,光谱分析技术,吸收光谱分析,可见光及紫外分光光度法,原子吸收分光光度法,红外分光光度法,发射光谱分析,火焰光度法,原子发射分光光度法,荧光光谱法,散射光谱分析,散射比浊法,透射比浊法,第一节 光谱分析技术,4/66,一、吸收光谱分析法,（,一）分光光度法基本原理,依据,Lambert-Beer,定律,，当一束平行单色光经过均匀非散射样品时，,吸光度与溶液层厚度和溶液浓度,成正比,入射光,I,0,透射光,I,第一节 光谱分析技术,5/66,式中,A,为吸光度；,K,为百分比常数，称为吸光系数；,L,为溶液层厚度，称为光径；,C,为溶液浓度,依据,Lambert,Beer,定律，当溶液层厚度单位为,1cm,，浓度单位为,1mol/L,时，吸光系数,K,称为,摩尔吸光系数（,）,是物质特征性常数。,在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质,不变，这是分光光度法对物质进行定性基础,第一节 光谱分析技术,6/66,应用,Lambert,Beer,定律时必须符合,3,个条件,：,二是被测样品必须是均匀介质,应用,Lambert,Beer,定律时必须符合,3,个条件：,三是在吸收过程中，吸收物质之间不能发生相互作用,一是入射光必须为单色光,第一节 光谱分析技术,7/66,8,Lambert,Beer,定律偏离现象：,溶液本身发生化学改变引发偏离,仪器原因引发偏离,溶液不是稀溶液时会引发偏离,非单色入射光会引发偏离,光散射、折射引发偏离,第一节 光谱分析技术,8/66,9,空白溶液,选择,样品空白,溶剂空白,不显色空白,平行操作空白,试剂空白,当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其它有色粒子时，选取空白溶剂参比,当样品基体溶液有颜色，而显色剂无颜色且显色剂也不与样品基体显色时，选取样品空白,当显色剂和被测试样都有颜色时，选取不显色空白,与样品分析完全相同操作步骤，用不含待测元素样品溶液进行平行操作,当显色剂或其它试剂有颜色，而被测试样中又无其它有色粒子时，选取试剂空白参比,第一节 光谱分析技术,9/66,10,（二）分光光度法在生化检验中应用,1,.对未知化合物进行定性分析,2,.对待测物质进行定量测定,（,1,）标准曲线法,（,2,）比较法,（,3,）其它分析方法,一、吸收光谱分析法,第一节 光谱分析技术,10/66,（,1,）标准曲线法,依据,Lambert-Beer,定律，液体浓度在一定范围内与吸光度成正比关系,待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其对应浓度,第一节 光谱分析技术,11/66,制作和应用标准曲线时应注意下面几点：,当测定条件发生改变时（如更换标准品、更换光电池或光源以及试剂批号不一样时），标准曲线应重新绘制,标准品应有高纯度，标准液配制必须准确,当待测液吸光度超出线性范围时，应将标本稀释后再测定,标本测定条件应和标准曲线制作时条件完全一致,标准溶液设置浓度范围须足够大，应到达观察拐点,第一节 光谱分析技术,12/66,（二）比较法,C,x,=(A,x,C,s,)/A,s,己知浓度标准品和标本作一样处理，使用相同空白，,同时测定标准管和标本吸光度，依据测定吸光度及标准,品浓度，可直接计算出标本浓度，计算公式为：,其中,C,x,和,A,x,为标本管浓度和吸光度，,C,s,和,A,s,分别为标准,管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品浓度应尽可能,和标本管浓度相近,（三）其它分析方法,包含差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法,第一节 光谱分析技术,13/66,二、发射光谱分析法,分子、原子或离子在辐射能作用下，由基态或低能态跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射形式释放出能量，由此而产生光谱,发射光谱,（一）火焰光度法,（二）荧光分光光度法,第一节 光谱分析技术,14/66,15,火焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化，因为原子能级改变，产生特征发射谱线,火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品中钠、钾测定,特征辐射,基态元素,M,激发态,M*,热能（火焰）,E,第一节 光谱分析技术,15/66,固定荧光发射波长而不停改变激发光（即入射光）波长，并统计对应荧光强度，所得到荧光强度对激发波长谱图称为荧光,激发光谱,使激发光波长和强度保持不变，不停改变荧光发射波长并统计对应荧光强度，所得到荧光强度对发射波长谱图称为荧光,发射光谱,荧光激发光谱,荧光发射光谱,荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激发态最低振动能级跃迁返回基态时所发射出光,荧光光谱临床应用：大量含有生物意义物质，都可采取荧光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等,第一节 光谱分析技术,16/66,17,三、散射光谱分析法,利用悬浮颗粒混浊液散射光强度或对入射光减弱原理进行定量分析方法,散射光谱分析法,（一）散射比浊法,（二）透射比浊法,第一节 光谱分析技术,17/66,18,散射比浊法基本原理：,一定波长光沿水平轴照射，经过溶液时，碰到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转角度与发射光波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少亲密相关，光强度与复合物含量成正比,透射比浊法基本原理：,当光线经过一定体积溶液时，因为溶液中存在颗粒（抗原抗体复合物）对光线反射和吸收，引发透射光降低，透射光透光率和粒子量成反比。经过测定透射光透光率来反应粒子量方法即透射比浊法,三、散射光谱分析法,第一节 光谱分析技术,18/66,第二节 电化学分析技术,19/66,第二节 电化学分析技术,利用物质电化学性质，测定化学电池电流、电位、电导、电量等物理量改变，从而测定物质组成及含量分析方法,电化学分析技术,灵敏、准确,仪器简单,快速、简便,价格低廉,它是电化学和分析化学学科主要组成部分,20/66,21,电化学分析法,电位分析法,测定原电池电动势以求物质含量分析方法,电导法,经过测定电阻以求物质含量分析法,电容量分析法 借助一些物理量突变作为滴定分析终点指示,第二节 电化学分析技术,21/66,22,电位分析法基本原理：,利用电极电位和浓度之间关系来确定物质含量分析方法，表示电极电位基本公式是,Nernst,方程式,电极电位测量：,因为单个电极电位绝对值无法测量，必须将,ISE,与参比电极共同浸入待测样品中组成一个原电池，经过测量原电池电动势（,E,电池）来测定,EISE,值,参比电极：,通常为负极，惯用有甘汞电极和银氯化银电极，其电极电位不随测定溶液和浓度改变而改变,一、电位分析法,第二节 电化学分析技术,22/66,23,ISE,基本结构,电极腔体：玻璃或高分子聚合物材料做成,内参比电极：通常为,Ag/AgCl,电极,内参比溶液：由氯化物及响应离子强电解质溶液组成,敏感膜（电极膜）,离子选择性电极分析法,(ion selective electrode,，,ISE,),是电位分析法中发展最为快速、最为活跃分支,第二节 电化学分析技术,23/66,惯用离子选择性电极（,ISE,）,玻璃膜电极,敏感膜由玻璃材料制成，最常见为,pH,玻璃电极,气敏电极,气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感而设计一类敏化电极。如氨气敏电极,酶电极,酶电极是另一个敏化电极，其原理是将含酶凝胶涂布于离子选择性电极敏感膜上组成酶电极,第二节 电化学分析技术,24/66,离子选择性电极分析方法：,标准曲线法,配置一系列浓度标准溶液，对测得系列电动势,(E),值与浓度对数,(lgC),作图，得,E,lgC,标准曲线,标准比较法,在相同条件下测定标准溶液和待测溶液,E,s,和,E,x,值，因为标准溶液浓度,C,s,是已知，依据比较法即可测出待测物质浓度,C,x,标准加入法,该方法适合用于体系比较复杂，且与标准溶液浓度有较大差异待测液,第二节 电化学分析技术,25/66,直接法指样品不经稀释直接由电极测量离子活度,优点是可采取全血测定，它快速方便，结果准确，不会因血清中水体积所占百分比改变而影响结果,间接法指样品经一定离子强度缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度,优点是样品用量少；因为样品预先进行稀释，不易堵塞管道；降低了血脂、不溶性蛋白质对电极污染及损耗，使电极寿命延长,样品测定方法：,第二节 电化学分析技术,26/66,离子选择性电极对任何标本测量，都可能存在离子强度、络合剂及干扰物质影响，不一样分析方法其影响大小不一样,通常在标准溶液及标本溶液中加入与待测离子无干扰浓度较大电解质溶液，作为总离子强度调整缓冲液（,total ionic strength adjustment buffer,，,TISAB,）,TISAB,可保持较大且相对稳定离子强度，使活度系数恒定；维持溶液在适宜,pH,范围内，满足离子电极要求；还能掩蔽干扰离子,电极分析法影响原因,：,第二节 电化学分析技术,27/66,电极分析法在临床检验中应用,电解质分析仪,第二节 电化学分析技术,28/66,第二节 电化学分析技术,二、电导分析法,将被分析溶液放在固定面积、固定距离两个电极所组成电导池中，经过测定电导池中电解质溶液电导值来确定物质含量,电导分析法,检测红细胞压积,红细胞因为其含有脂质双分子层膜结构而被认为是电绝缘体,血细胞计数,其原理基于血细胞电导率低于作为悬浮介质盐溶液电导率（“库尔特原理”）,应用,29/66,第二节 电化学分析技术,三、电容量分析法,依据滴定过程中电极电位改变来确定滴定终点分析方法。滴定过程中，伴随滴定剂加入，发生化学反应，待测离子或与之相关离子活度（浓度）发生改变，指示电极电极电位（或电池电动势）也伴随发生改变，在化学计量点附近，电位（或电动势）发生突跃，由此确定滴定终点,电容量分析法,30/66,第三节干化学分析技术,31/66,第三节干化学分析技术,指将液态样品如血浆、血清、尿液等置于含有试剂固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成份浓度或活度一项技术,干化学分析,是一个专门使用固相载体试剂进行临床化学检验分析仪，它经过反射光度法、差示电位法等方法定量测出样品中特定成份浓度或活度,干化学分析仪,32/66,33,干式化学多层膜试剂载体,基于反射光度法多层膜,基于差示电位法离子选择电极多层膜,基于荧光技术和竞争免疫技术荧光反射光度法多层膜,干化学技术普遍采取多层膜固相试剂技术，即干式化学多层膜试剂载体，它集中当代化学、光学、酶工程学、化学计量学和计算机技术于一体，已使其作为定量方法,一、干化学分析技术基本原理,第三节干化学分析技术,33/66,34,理论基础：遵从,Kubelka-Munk,理论,光反射率与固相层厚度、单位厚度光吸收系数以及固相反应层散射系数相关系，当固相层厚度和固相反应层散射系数固定时，光吸收系数同待测物浓度成正比,（一）反射光度法,第三节干化学分析技术,34/66,35,多层膜干片结构,（,1,）样本扩散层,（,2,）反射层,（,3,）辅助试剂层,（,4,）试剂层,（,5,）透明支持层,基于反射光度法多层膜干片结构示意图,第三节干化学分析技术,35/66,基于传统湿化学分析离子选择电极原理，用于测定无机离子,（二）差示电位法,多层膜结构,（,1,）离子选择性敏感膜（,2,）,参比层,（,3,）,氯化银层,（,4,）,银层,（,5,）支持层,第三节干化学分析技术,36/66,37,干化学自动分析仪已广泛应用于检验医学各个方面，检测项目已多达,70,余项，包含常规生化、内分泌激素、毒素、药品浓度分析以及特种蛋白等免疫学检验,干化学分析仪分类,反射光度法系统,胶片涂层技术分析系统,袋式分析仪,二、干化学分析技术在临床检验中应用,第三节干化学分析技术,37/66,38,干化学分析法特点：,速度快，灵敏度和准确度与经典分离式仪器相近,应用,Lambert,Beer,定律时必须符合,3,个条件：,超微量，操作简单，占用空间小，使用过程中灵活机动性强,脱离了传统分析方法，全部测定参数均存放于仪器信息磁场块中,第三节干化学分析技术,38/66,39,区分点,干化学,湿化学,试剂,固相，大多无需定标，稳定周期长（数月），全血可直接上机检测,液体，需要定标，稳定周期短，全血不可直接上机检测,仪器,磁卡校正，无需排水系统，分析前后无需清洗,每次测试标准上需要校正，需要排水系统，测试前后需清洁,反应载体,固相介质,反应杯,检测方法,反射光度法,透射光度法,电解质测定,差示电位法,离子选择性电极法,理论基础,Kubelka-Munk,理论和,Williams-Clapper,公式,Lambert-Beer,定律,干化学和湿化学生化检测主要区分,第三节干化学分析技术,39/66,40,1.,仪器监测,2.,校准频度,3.,质控物,4.,干片试剂储存与使用,5.,工作环境温度和湿度,三、干化学分析技术影响原因,第三节干化学分析技术,40/66,第四节电泳分析技术,41/66,第四节电泳分析技术,1937,年瑞典,Tiselius,创造了,Tiselius,电泳仪，最早建立了研究蛋白质移动界面电泳方法,1948,年,Wieland,和,Fischer,重新发展了以滤纸作为支持介质电泳方法,1950,年,Durrum,用纸电泳进行了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质区带电泳方法,1959,年,Raymond,和,Weintraub,利用人工合成凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,由,80,年代发展起来新毛细管电泳技术,由,90,年代至今，电流分析仪最大改变特点为自动化程度日益提升，应用领域大大增加,42/66,一、电泳分析技术基本原理,溶液中带电粒子在电场中定向移动现象称为电泳,电泳,利用电泳现象对物质进行分离技术叫电泳技术,电泳技术,第四节电泳分析技术,43/66,(,一,),蛋白质两性电离及等电点,蛋白质等电点（,pI,）：,假如在某一,pH,值溶液中，蛋白质所带正负电荷相等，即蛋白质净电荷为零，蛋白质电离为兼性离子时，该溶液,pH,值称为该物质等电点,粒子荷电量能够经过调整,pH,值与,pI,之间差值加以控制，差值越大，粒子荷电量越多,第四节电泳分析技术,44/66,(,二,),电泳迁移率,电泳迁移率,是指在单位电场强度时带电粒子迁移速度,带电粒子因为各自电荷和形状大小不一样，因而在电泳过程中含有不一样迁移速度，形成了依次排列不一样区带而被分开。即使两个粒子含有相同电荷，假如它们分子大小不一样，所受阻力不一样，所以迁移速度也不一样，在电泳过程中就能够被分离,迁移率与带电粒子所带净电荷成正比，与粒子大小和缓冲液黏度成反比,第四节电泳分析技术,45/66,血清蛋白,等电点,电泳迁移率（,cm,2,/sV,）,清蛋白,4.84,5.910,-5,1,-,球蛋白,5.06,5.110,-5,2,-,球蛋白,5.06,4.110,-5,-,球蛋白,5.12,2.810,-5,-,球蛋白,6.85,7.30,1.010,-5,血清蛋白等电点和电泳迁移率,第四节电泳分析技术,46/66,影响原因,分子形状与性质,球形移动速度快,纤维状移动速度慢,电场强度,高电场强度,电泳速度加紧，电流强度也增大，产热增多,低电场强度,电泳速度减慢。电泳时间增加，增加了标本扩散,电泳缓冲液,pH,值,:,普通设在,4.5,9.0,为宜,缓冲溶质,:,化学性质稳定、缓冲容量大、电导率低、离子移动性好,离子强度,:,缓冲液导电能力,以,0.05,0.1mol/L,为宜,支持介质,吸附作用：吸附作用可阻滞标本移动，出现区带拖尾现象,电渗作用：电场中液相对固相相对移动称为电渗,蒸发,(,三,),影响电泳原因,第四节电泳分析技术,47/66,支持介质电渗作用,第四节电泳分析技术,48/66,二、惯用电泳分析技术及应用,按电泳方式分类,移动界面电泳,区带电泳,稳态电泳,第四节电泳分析技术,49/66,B,E,A,F,以醋酸纤维素薄膜作为支持介质一项电泳技术,以琼脂糖凝胶作为支持介质一项电泳技术,利用有,pH,梯度介质分离等电点不一样蛋白质电泳技术,以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质一项电泳技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,等电聚焦电泳,按电泳,支持物分类,第四节电泳分析技术,50/66,二、惯用电泳分析技术及应用,1,.醋酸纤维素薄膜电泳,优点：醋酸纤维素几乎不带电荷，吸附作用和电渗作用都很微弱；分辨率高，区带清楚；不吸附染料，区带周围染料可完全漂洗洁净；极易透明，便于区带扫描定量；透明后薄膜易于干燥，电泳区带可长久保留,缺点：吸水性较差，较脆，电泳时水分轻易蒸发。所以要求电泳槽密闭性能要好，一直维持水蒸气饱和，电流强度不宜过大，普通保持在,0.40.6mA/cm,宽为宜,第四节电泳分析技术,51/66,2.,琼脂糖凝胶电泳,优点：琼脂糖凝胶透明度好，便于区带扫描。适合于免疫复合物、核酸与核蛋白分离、判定及纯化，在临床生化检验中惯用于,LDH,、,CK,等同工酶检测,缺点：电泳完成后区带易扩散，可及时固定,第四节电泳分析技术,52/66,3.,聚丙烯酰胺凝胶电泳,优点：,1.,现有电荷效应又有分子筛效应，分离效果好,2.,化学稳定性高，是一个稳定亲水胶体,3.,几乎没有吸附和电渗作用,4.,机械强度好，无色透明，可直接光密度扫描,5.,可调整凝胶孔径以适合不一样分子量分离,第四节电泳分析技术,53/66,4.,等电聚焦电泳,是利用有,pH,梯度介质分离等电点不一样蛋白质电泳技术,等电聚焦（,isoelectric focusing,，,IEF,）,优点：,IEF,是一个简便、快速、高效分离分析方法，尤其适合用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量控制、临床诊疗等方面要求,第四节电泳分析技术,54/66,(,三,),电泳区带测定,电泳区带定性、定量测定,直接法,用紫外光扫描仪直接扫描电泳区带,染色法,将电泳区带用染料染色，洗脱背景，然后将区带一一剪下用溶剂洗脱比色,第四节电泳分析技术,55/66,(,三,),电泳区带测定,1.,区带定性分析主要观察有没有异常区带出现,2.,区带定量分析区带定量分析惯用光密度扫描法或洗脱比色法,第四节电泳分析技术,56/66,三、自动电泳仪分析技术,自动电泳仪电泳过程，包含加样迁移染色去色烘干，都依次按程序自动进行,自动电泳仪分类,全自动荧光,/,可见光双系统电泳仪,全自动醋纤维膜电泳仪,全自动琼脂糖电泳仪,第四节电泳分析技术,57/66,第五节 基因扩增技术,58/66,第五节 基因扩增技术,聚合酶链反应（,PCR,）：又称无细胞分子克隆系统或特异性,DNA,序列体外引物定向酶促扩增法。能使人们在几小时内从试管中取得大量特异核酸片段。临床试验室主要用于对病毒、细菌、支原体及其它病原体检测,一、,PCR,反应基本原理,PCR,是在试管中进行,DNA,复制反应，基本原理与细胞内,DNA,复制基本相同。每一次循环复制包含,3,个步骤：,1.,变性,2.,退火,3.,延伸,59/66,2.,退火（,annealing,）即在较低温度,(40,70),下使加入引物与待扩增,DNA,区域特异性结合，以提供,DNA,复制起始,3-OH,端,3.,延伸（,extension,）即在适当温度下（,70,75,），,DNA,聚合酶特异性结合到,DNA,模板上引物,3-OH,端，以,dNTP,为反应原料，以靶序列为模板，依据碱基互补配对标准，进行,DNA,链延伸，即合成,DNA,新链,1.,变性（,denature,）经过加热至,95,左右，使,DNA,双螺旋氢键断裂，形成,DNA,单链模板而游离于反应体系中，此过程称为变性,第五节 基因扩增技术,60/66,61,上述,3,个步骤重复循环，使得特定长度靶,DNA,数量呈指数上升。在理论上，终产物,DNA,量可用,Yn=X2,n,计算,第五节 基因扩增技术,61/66,PCR,反,应体系,模板就是被复制核酸片段,引物是,PCR,特异性反应关键，为化学合成寡核苷酸,可稳定核苷酸和提升,Taq DNA,聚合酶活性,MgCl,2,浓度普通为,1.5mmol/L,为宜,在扩增过程中，当温度上升至,72,时，反应体系,pH,在,7.2,左右。,其它反应原因,引物,模板,镁离子浓度,即,dNTP,为,dATP,、,dCTP,、,dGTP,和,dTTP,四种脱氧核苷三磷酸混合物,脱氧核苷三磷酸（,dNTP,）,催化,DNA,合成，即在模板指导下，以,dNTP,为原料，使,DNA,链沿,53,方向延伸,Taq DNA,聚合酶,B,E,A,F,C,D,第五节 基因扩增技术,62/66,63,注意事项,1,.试验室布局要求划分操作区,2,.操作人员必须进行上岗培训,3,.分装试剂,PCR,扩增所需要试剂均应在装有紫外灯超净工作台或负压工作台配制和分装,4,.试验操作注意安全防护,5,.标本搜集建立标本收检标准操作程序并对标本采集人员进行培训,6,.标本保留和运输标本应新鲜，不能马上检测标本应置,20,以下保留,第五节 基因扩增技术,63/66,利用,Taq,酶,53,外切酶活性，在,PCR,反应系统中加入一个荧光标识探针,二、荧光定量,PCR,基本原理,依据上述原理研制了定量,PCR,扩增仪，当荧光信号增强到某一阈值（,C,t,值）就被统计下来。,C,t,值与标准模板数量对数值之间有严格线性关系，利用系列标准模板,C,t,值，制成标准曲线，依据待测样品,C,t,值，就可在标准曲线中确定待测样品起始,DNA,数量,第五节 基因扩增技术,64/66,65,人类遗传疾病诊疗与研究，如地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症等致病基因检测,病原体检测，包含细菌、病毒、支原体、衣原体以及原虫等检测，用于传染病诊疗、变异株分析、流行病学研究,肿瘤检测，如检测白血病、淋巴瘤、消化道肿瘤等细胞基因改变,其它，如优生检测、法医学等,三、,PCR,反应技术在临床应用,第五节 基因扩增技术,65/66,66,谢 谢！,66/66,
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