实验一二重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法.ppt

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DNA),1.2,质粒的三种构型,9,(2),开环,DNA(open circular DNA,OC DNA),如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。,10,(3),线状,DNA(linear DNA,L DNA):,如果两条链均断开，即为线状,DNA,。,电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,11,最快,中,最慢,1.3,质粒,DNA,的一般特性：,(1),质粒是细菌内的共生型遗传因子,有,相对独立性,。,(2),它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些,表型,：菌毛、抗药性等,(3),它是,双链闭合环状,DNA,，分子量大小不等。,(4),质粒,DNA,与宿主菌染色体,DNA,的两点不同：,宿主菌染色体,DNA,通常比质粒,DNA,要大得多,纯化分离的宿主菌,DNA,多为线性分子，而质粒,DNA,呈闭合环的形式。,13,1.4,提取质粒,DNA,的目的与意义：,基因载体,/,基因克隆,/,基因工程,2.1,提取质粒,DNA,的常规方法,(1)SDS,碱裂解法,(2),煮沸法,(3)high pure plasmid isolation kit,等。,但原理相似，都是利用宿主染色体,DNA,和质粒,DNA,的差异来分离的。,2,提取大肠杆菌质粒,DNA,的方法和原则,2.2,分离纯化质粒,DNA,的主要步骤,(1),培养细菌使质粒扩增（,DNA,的扩增与选择）,(2),细菌的收集与裂解,收集方法：高速离心的方法,裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、,碱变性法,、,沸水,热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。,根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的,纯化方法等因素综合后加以选择。,(3),质粒,DNA,的纯化,常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等,所有纯化方法都是利用了质粒,DNA,相对较,小及共价闭合环状的性质。,2.3,核酸分离纯化的总原则：,(1),保证核酸一级结构完整,(2),排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、,糖、,有机溶剂、金属离子、其他,DNA,、,RNA,等）,3.SDS-,碱裂解法提取,Puc119-U6,重组质粒,DNA,3.1,实验原理：,高碱,细菌的细胞壁破裂，内容物释放,染色体,DNA,断裂成不同长度的线性双链,DNA,；,线性双链,DNA,片段中的氢键断裂，双链解离变性。,质粒,DNA,不发生断裂，保持双链闭合环状；,双链,DNA,并不完全分离。,高酸中和至中性,变性的染色体,DNA,与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物,质粒,DNA,又恢复天然构型，溶解在上清液中,纯化,RNA,酶消化除去,RNA,，并用酚抽提法除去残留的蛋白质,3.2,主要试剂及作用,溶液：由葡萄糖、,EDTA、Tris,H,Cl,组成.,(,保护、缓冲,),葡萄糖,的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械,剪切作用,防止破坏质粒.,(,保护作用,),EDTA,的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止,DNA,酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）,TrisHCl,能使溶菌液维持溶菌作用的最适,PH,范围（缓冲作用）,19,溶液,II：,由,SDS（,十二烷基硫酸钠）与,NaOH,组成,(,裂解、变性,),SDS,的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之,变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）,NaOH,（,PH12,）的作用是破坏氢键，使,DNA,分子变性（,DNA,变性作用）,20,溶液,III：HAC(,乙酸,),和,KAC(,乙酸钾,),组成的高盐溶液,(,复性，分离,),HAC,溶液,能中和溶液的碱性，使染色体,DNA,变性而发生缠绕，并使质粒,DNA,复性。,KAC,会与,SDS,形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成,沉淀而除去；溶液中的,DNA,也会与蛋白质,-SDS,复合物缠绕成大分子而与小分子质粒,DNA,分离。,3.3,实验步骤,加,1.5ml,培养物于,EP,管，,12000g30S,除去上清，加入冰的,200 l,溶液,I,，剧烈振荡,EP,管，室温,3min,加入,200l,溶液,II,，快速颠倒数次，冰浴,3min,加入,150l,冰,溶液,III,，温和振荡,10s,，冰浴,5min,，,12000g5min,转移上清到新,EP,管，加入等体积,酚,/,氯仿,(1:1),，温和振荡，冰浴,3min,，,12000g5min,上层水相转移到新,EP,管,，加入,2,倍体积,无水乙醇,，颠倒混匀，,-20,冰箱中放置,15min,，,12000g,10min,弃上清，沉淀中加,1ml,70%,乙醇,，,12000g5min,去上清，管平放室温静置,10min,，,20 l TE,溶解,DNA,RCF,=,1.12r,（,rpm/1000),2,RCF:,离心力（,g,）,r:,离心半径（,mm,）,rpm:,每分钟转速（,r/min,）,注意事项：,1、加样枪正确使用；,2、标记自己所提取的质粒类型；,3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；,4、加不同溶液要换枪头；,5、离心前把管擦干；,6、转移上清时不要吸到沉淀；,7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到,皮肤；,8,、,每人最终得到,20ul,质粒,DNA,，其中,10ul,用于酶,切和电泳，其余,10ul,用于下次的转化实验，切,记！,二、限制性内切酶切割重组质粒,1,关于限制性核酸内切酶 （,restriction endonuclease,）,1.1,定义,能在特异位点（酶切位点）上催化双链,DNA,分子的断裂,产生相应的限制性,DNA,片段。,主要存在于细菌体内。,切割不同来源的,DNA,分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（,“,分子手术刀,”,）。,25,1.3,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA，,保护自身,DNA。,1.2,分类,、,（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,1.4,命名,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,2 BamHI,、,Hind,酶切质粒及鉴定,2.1,实验原理：,利用限制性内切酶特异的识别,DNA,特异的核苷酸序列，并切割,DNA,产生一定长度的,DNA,片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒,DNA,）,28,重组质粒,BamH,I,Hind,III,双酶切,电泳检测,5-G A A T T C-3,3-C T T A A G-5,BamH,I,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5,Hind,III,PUC119,（,3.2Kb,）,U6,启动子（,256bp,）,2.2,实验材料,:,(1),重组质粒,;,(2),BamHI,、,Hin,d,限制性内切酶,;,(3),反应缓冲液。,31,2.3,实验步骤,(1),建立反应体系,(2),酶切反应（温育,1-2h,）,(3),电泳鉴定,32,2.4,双酶切体系,质粒,DNA,10,l,10M buffer 2l,BamH,1l,Hind 1l,ddH,2,O 6,l,33,合计,20l,准备室老师已加好,同学自己加,37,，,1-2h,思考题？,为什么要对重组质粒,DNA,进行双酶切？,34,1,原理,在,pH8.0,（碱性）的环境中,DNA,的磷酸基团解离，使,DNA,在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种,DNA,分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。,DNA,显色剂多用,EB,，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（,530nm,）的荧光。,35,三、酶切质粒,DNA,后的琼脂糖凝胶电泳,1.1,影响,DNA,在凝胶中迁移速率的因素,1 DNA,分子的大小,2,构象,3,凝胶浓度,4,电压,5,缓冲液,1.2,不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围,琼脂糖浓度,（，,W/V)DNA,分子的有效分离范围（,kb),0.7 0.8-10,0.9 0.5-7,1.2 0.4-6,1.5 0.2-3,2.0 0.1-2,2,实验材料及试剂,琼脂糖,电泳缓冲液：,1,TAE,10,加样缓冲液,EB,染色液,它能和碱基间的氢键结合，在波长为,254nm365nm,的紫外光照射下呈橘红色（,530nm,）的荧光,.,琼脂糖凝胶板的制备,（封板、制备,1%,凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）,倒缓冲液，加样,（,取酶切质粒,DNA,样品液,20l+4,l,上样缓冲液，混匀）,电泳（,100V 0.5,小时，,5V/cm,）,染色与检测,（,EB,染色,5 min,，洗脱,3min,，紫外灯下检测）,3,实验步骤,一、电泳前准备,准备内容,作用,1.,刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干,防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。,2.,检查电泳槽，根据情况更换,buffer,排除电泳槽的电极接触不良，确保,buffer,的缓冲能力，减少污染。,3.,根据,DNA,的分离范围选择合适的胶浓度并记录,达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。,4.,计算,agarose,的用量和制胶,buffer,的用量记录，胶最终越薄越好。,实验记录备查,二、制胶,步骤,注意事项,1.,称量,agarose,和,buffer,Buffer,不要用成,H2O,，称量相对准确,2.,融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。,非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积,2,倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。,3.,倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到,60,度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。,制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。,EB,如果在制胶时加入，在,60,度左右时加入，使终浓度为,0.5ug/ml,。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如,2%,以上的,EB,很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用,EB,染色。,4.,室温凝胶,30,分钟,过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。,5.,拔梳子，放入电泳槽。,缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶,1mm,。,三、上样电泳,步骤,注意事项,1.,样品中加入,loading buffer,使其终浓度为,1 X,，混匀,Loading buffer,浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。,2.,点样,沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取,buffer,洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。,3.,接通电源，选择合适的电压和时间电泳。,胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。,四、染色成像,步骤,注意事项,1.,染色,如果胶中没有加入,EB,，用,0.5ug/ml,的,EB,溶液浸染,30,分钟。,2.,调整镜头的拍摄范围和焦距，成像,3.,打印照片做分析记录,思考题？,酶切前后的对比？,44,M,酶切后,酶切前,点样孔,细菌基因组,DNA,OC,型质粒,DNA,L,型质粒,DNA,SC,质粒,DNA,细菌,RNA,质粒电泳图谱,四、紫外分光光度法检测,DNA,浓度,1,分光光度技术,1.1,概述,分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术,。,47,1.2,特点,灵敏度高：测定下限可达,10,5,10,6,mol/L,准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差,2,5,（,1,2,）,;,操作简便快速,;,应用广泛。,48,2.1,分光光度计的基本部件,光 电,49,2,紫外分光光度法的原理,（氢灯、氘灯）,入射光反射光分散光吸收光透过光,用溶剂作为,“,空白,”,校正反射光、分散光,入射光（,I,0,）吸收光透过光（,I,t,）,50,光吸收基本定律,:Lambert-Beer,定律,D,K C L,吸光度,摩尔消光系数 吸收物质的光径（,cm,）,溶液浓度（,mol/L,）,2.2,分光光度法分析的依据,：,物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物质的结构，这就是分光光度法,定性,分析的依据；,其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光光度法,定量,分析的依据。,51,2.3,吸收池,或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装被测溶液和决定透光液层厚度的器件。,一般由玻璃或石英制成，,注意：,a.,与光束垂直；,b.,规格相同；,c.,清洁。,52,2.4,紫外分光光度法检测,DNA,的原理,原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在,260nm,处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。,优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。,缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。,53,产生误差的原因：,1.,单色性不纯的影响；,2.,杂散光的影响；,3.,比色皿的影响；,4.,温度、,pH,值的影响；,5.,吸光度读数时的误差。,54,3,实验步骤,用,0.1TE,对待测,DNA,样品按,1:20,稀释,0.1,TE,作为空对照,在波长,260nm,、,280nm,、,310nm,处分别测标准,DNA,样品的,OD,值,根据,OD,值计算,DNA,浓度（,g/ml,）,单链,DNAssDNA,=33(OD,260,OD,310,),稀释倍数,双链,DNAdsDNA,=50(OD,260,OD,310,),稀释倍数,4.DNA,的纯度鉴定,OD,260,/OD,280,=1.8,（,RNA,为,2.0,）,1.8,可能有,RNA,污染,1.8,可能有蛋白质污染,55,Thank you！,2006.04.06,