弱反应性标本结果处理及报告.ppt

2010.03.03,弋矶山医院检验科,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫测定弱反应性,(,弱阳性,),的 来源,临床标本原因,CUT-OFF,值的设定,一,.,临床标本原因,可能导致假阳性结果的标本因素,内源性干扰因素：,类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶等,外源性干扰因素：,溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全等,类风湿因子干扰的排除,稀释标本,改变酶标抗体,用变性,IgG,预先封闭标本中,RF,测抗原,可加入还原剂如,2-,巯基乙醇去除,RF,使用特异的鸡抗体,IgY,作为酶标或固相抗体,2.,补体干扰,固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其,Fc,段的补体,C1q,结合位点被暴露出来，这样,C1q,就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现,假阳性结果,。,固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起,假阴性结果,或使定量测定结果偏低,。,补体干扰的排除,56 30min,加热可使标本中补体,C1q,灭活,使用特异的鸡抗体,IgY,作为酶标或固相抗体,3.,异嗜性抗体的干扰,天然的异嗜性抗体（,IgG,）可分为两类,:,一类（,85%,的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛,IgG,的,Fab,区域，但不与兔,IgG,的,Fab,区结合。,另一类（,15%,的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔,IgG,的,FC,区表位，但不与山羊和大鼠,IgG,的,FC,区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。,异嗜性抗体干扰的排除,使用特异的兔,F,(ab,)2,片段作为固相或酶标抗体。,在标本或标本稀释液中加入过量的动物,Ig,，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。,使用靶特异的非,Ig,亲和蛋白（,Affibody,）替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌,A,蛋白（,SPA,）联合文库的人,IgA,结合亲和蛋白，用于,IgA,的测定，不受异嗜性抗体的影响。,使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。,4.,抗鼠,Ig,抗体的干扰,抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的酶免疫测定，可产生假阳性结果,抗鼠,Ig,抗体干扰的排除,使用特异的抗体,F,(ab,)2,片段作为固相或测定酶标抗体。,在标本或标本稀释液中加入过量的鼠,Ig,，封闭可能存在的抗鼠抗体。,使用特异的鸡抗体,IgG,作为固相和测定抗体。鸡,IgG,不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或酶标抗体不会出现假阳性结果。,5.,溶菌酶干扰,溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为,5,，因此，在双抗体夹心法,ELISA,测定中，溶菌酶可在包被的,IgG,和酶标的,IgG,间形成桥接，从而导致,假阳性,。,溶菌酶,干扰的排除,为保证,ELISA,测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，,Cu,2+,离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接,IgG,。,（二）外源性干扰因素,1.,标本溶血,注意避免出现严重溶血。,血红蛋白中含有血红蛋白，有类似过氧化物的活性，因此，在以,HRP,为标记酶的,ELISA,测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的,HRP,底物反应显色。,2.,标本被细菌污染,细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用,细菌的内源性酶会对测定方法产生非特异性干扰。,3.,标本贮存时间过长,标本在,28,下保存时间过长，,IgG,可聚合成多聚体，在间接法,ELISA,测定中会导致本底过深、,甚至造成假阳性,。,血清标本如是以无菌操作分离，则可以在,2,8,下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在,70,以下。,4.,标本凝固不全,血液采集后，血液通常在半小时后开始凝固，,1824h,完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的,“,血清,”,并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在,ELISA,测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白，易造成,假阳性结果,血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。,二,.CUT-OFF,值,1.,相关的基本概念,2.CUT-OFF,值与“灰区”,3.,结果的报告,1.,基本概念,准确度、标准差,(SD,或,s),、变异系数（,CV,）、不精密度（重复性）、测定范围,测定下限和测定敏感性,、灵敏度、特异性,阳性测定能力指数,DI(,),、阴性测定能力指数,DI(,),、阳性测定的可靠性和阴性测定的可靠性,基本概念,标准差,适用于正态分布的标准差（,SD,），不能泛泛地用于酶免疫测定结果的判定。这是因为阴性参考血清的酶免疫测定值的分布常为非正态分布，呈一正向偏斜。,基本概念,变异系数,重复性（,Reproducibility,）：一般通过重复两次测定样本来观察。,测定下限（,Detectability,）：是指超过零剂量精密度的最低抗原浓度，可通过,t,分布（一边拖尾，因为此时曲线只有上升趋势）计算在测定下限时的吸光度值的均值差。,测定敏感性（,Sensitivity):,是指一实验的测定反应对待测物质浓度变化的改变。,基本概念,阳性测定能力指数,（,DI,（）可定义为一实验对阳性标本测定后给出阳性结果的能力（通常称为,“,敏感性,”,）；,DI,（）,=,真阳性,/,（真阳性,+,假阴性）,100%,阴性测定能力指数,（,DI,（）则为对阴性样本测定给出阴性结果的能力（通常称为,“,特异性,”,）,DI,（）,=,真阴性,/,（真阴性,+,假阳性）,100%,基本概念,阳性结果的可靠性（,预示值,）,即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。,=,真阳性,/,（真阳性,+,假阳性）,100%,阴性结果的可靠性,则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。,=,真阴性,/,（真阴性,+,假阴性）,100%,结果报告需了解的概念,一般要考虑的问题,:,测定下限,(detection limits),阳性判定值,(Cut-off values),敏感性,(Sensitivity),特异性,(Specificity),符合率,(,功效率,)(Efficiency),金标准,(,“,Gold standards,”,),2.,定性免疫测定的,CUT-OFF,值,“,灰区,”,的计算,“,灰区,”,的范围可通过计算相应于这些,Cut-off,值的,u,统计值（假设为正态分布）而得到。,例如，阴性血清的,Cut-off,值,0.11,相应于阳性血清测定值分布的均值,2.21SD,，于是，一个,t,2.21,相应于,95.4,的可信限，因此可疑区域为,4.1,；同样，阳性血清的,Cut-off,值,0.08,相应于阴性血清测定值分布的均值,+1.058SD,，可得阴性的,“,灰区,”,为,14.0,。,选择,CUT-OFF,值的标准,（,Galen Gambino,建议）,敏感性最高,:,疾病严重，希望不要漏检，疾病可治，出现假阳性结果不会导致严重的心理或经济问题，治疗不当后果不严重。,特异性最高：,疾病严重但不可治，漏检无心理或公共卫生问题，或假阳性结果可能引起严重的心理或经济问题（如抗,HIV,确认实验）。,高预示值：,在不适当治疗会产生严重后果时。,高符合率：,疾病严重但可治，假阳性或假阴性结果同等严重时。,要在上述指标之间达到一个适当平衡，试剂研制需检测三个人群的样本：,感染者、健康者、,其他疾病（非特定疾病感染者）者。,确定,CUT-OFF,值的方法一：,标准差比率法,预先假定一个,cut-off,值，然后测定大量的标本，将测定反应如吸光度（,OD,）值大于此假定,cut-off,值的弃掉,计算余下的测定反应的均值（,M1,）和标准差（,SD1,），再将超出,M1+5 SD1,的测定值弃去；最后计算余下的测定值的均值（,M2,）和标准差（,SD2,），以,M2+2 SD2,作为测定的,cut-off,值。,确定,CUT-OFF,值的方法二：,均值,2,或,3,个,SD,法,首先测定大量（数千）正常人血清样本，然后将所得到的吸光度均值,2,或,3,个,SD,作为阳性判断值,确定,CUT-OFF,值的方法三：,综合阴阳性测定值法,如测定值为正态分布，则根据,u,检验，以单侧,99.5%,的可信限先分别确定阴性和阳性的,Cut-off,值；如为非正态分布，则百分位数法单侧,95,或,99,来确定,Cut-off,值。,确定,CUT-OFF,值的方法四：,综合考虑加转化血清盘法,ROC,曲线在,Cut-off,值设定中的应用,ROC,是英文,Receiver Operating characteristic,的缩写，可直译为接收机工作特性，其最初主要是用于雷达领域。在临床医学检验领域内，,ROC,不仅可用于不同检验方法之间的比较，而且可用于对检验项目临床准确性的评价以及决定正常和异常的分界点。,ROC,曲线,描述的是：,真阳性率,(TPR),（又称,灵敏度）,=,真阳性数,/(,真阳性,+,假阴性,),假阳性率,(FPR),=,假阳性数,/(,假阳性,+,真阴性,),；,以,FPR,为横坐标、,TPR,为纵坐标所作出来的一条曲线,根据这种关系，可确定区分正常与异常的分界点究竟在何处最为合适，也就是说此时的假阳性和假阴性率最低或比例最为适当或最为符合使用目的。因此，当然就可以用于,ELISA,测定,Cut-off,值的确定。但注意血站与临床应用应有所区分，血站应更严格（一般为临床,Cut-off,值,50%,）。,ROC,曲线应用（确定,Cut-off,值）,定性测定结果的确定,定性测定结果确定的依据在于阳性,阴性判定值（,Cut-off,）的建立，,Cut-off,值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。,除了,Cut-off,值以外，还有许多其它的设值方法以判断阴性和阳性结果，如,S/N,（常称为,P/N,）比值（,Ratio,）等。,CUT-OFF,值的不确定性可致假阳性,3.,测定结果的报告,酶联免疫吸附试验的报告在理想情况下应达到下述要求（至少）,:,(1),易于让不熟悉该试验的人所理解,;,(2),定性测定必须结果明确,即阳性或阴性，在正常范围内或不正常等；,（,3,）数据的可重复性；,结果报告和解释,阴性或阳性的概念问题？,试验解释 临床解释,reactive,有反应性 阳性,nonreactive,无反应性 阴性,临界结果（灰度区）的处理,重要的是建立进一步检测的程序,：,标本的重复检测,第二份标本的检测,数周或数月后采取样本检测,可能的话，用另一个更敏感特异的,方法（确认试验）检测,确认实验,中和试验：如,HBsAg,检测加,HBsAb,重组免疫印迹（,RIBA,）,reconbinant immunoblot assay,蛋白印迹（,WB,）,确认实验,(confirmatonry test),特异性应,98-99%,可为非免疫学（如培养或核酸检测）或免疫学方法,免疫学方法包括蛋白印迹、抗原或抗体封闭阻断试验,如果一个检测方法特异性很高或高阳性预示值，则不必进行确认。,结果的报告,认真阅读试剂盒说明书，按照其要求报告结果,如出现临界结果，应明确是否需对患者进一步追踪观察,清楚说明结果对特定疾病诊断意义（可能性高或不可能）和,/,或需进一步检测。如果已在进行进一步的检测，应在报告中予以说明,结果的解释,结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。,临床解释的责任属于临床医生，其应根据临床信息解释结果。,临床实验室与临床医生的对话对适当利用实验室数据非常重要。,结果报告程序建议：,阳性,(,反应性,),结果对被检者有重大影响,不管阳性程度如何,建议确认,(,中和试验、蛋白印迹、其他标志物等）,如无重大影响，阳性结果直接报告。,如为弱反应性，则可采取以下步骤鉴别：,其他相关标志物情况,重复检测（其他更敏感方法）,-,确认试验（必要时）,-,追踪,阴性（非反应性）结果如,S/CO 0.5,观察其他相关指标,追踪,.,谢谢！,