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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2.,干细胞分类,(1),胚胎干细胞,：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚期内细胞团的细胞。,(2),成体干细胞,：指成体各组织器官中的干细胞，成体干细胞具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应,(,或相邻,),组织器官组成的细胞。如神经干细胞，表皮干细胞。,第一节 干细胞生物学,1.,组织自体稳定性,：,特定组织通过使自身,细胞死亡,和,增生,的方式保持组织细胞数量动态平衡的特征称,组织自稳定性,。,2.,干细胞是,个体发育,和,组织再生,的基础。,一、干细胞的形态和生化特征,二、干细胞的增殖特征,（一）增殖缓慢性,1,干细胞增殖速度慢,：细胞动力学研究表明，干细胞的增殖速度较慢，组织中快速分裂的细胞是,过渡放大细胞,。,如小肠干细胞的分裂速度,(,Tc,=11,小时,),比过渡放大细胞,(,Tc,24,小时,),慢一倍。,2,过渡放大细胞：,过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，过渡放大细胞经若干次分裂产生分化细胞。,通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多分化细胞。,3,干细胞增殖缓慢的意义：,(1),利于干细胞,对外界信号作出反应,，以决定细胞的发展方向增殖或分化。,(2),减少基因突变的危险,。增殖缓慢使干细胞有时间发现并纠正处于增殖周期过程中的错误。,（二）干细胞的自稳定性,1,自稳定性,：,自稳定性是干细胞的基本特征之一。指干细胞可在个体生命过程中,自我更新,并,维持其自身数目恒定,。,干细胞的自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征。,干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。,2,干细胞的分裂方式,干细胞有,对称,与,不对称,两种分裂方式。,对称分裂：干细胞,分裂,干细胞,干细胞,对称分裂：干细胞,分裂,分化细胞,分化细胞,不对称分裂：干细胞,干细胞,分化细胞,分裂,不对称分裂的,结果,使两个子细胞一个成为功能专一的,分化细胞,；另一个保持,干细胞,的特征。,3.,不对称分裂发生原因,：,系列基因调控。,细胞质物质不均等分配。,4,无脊椎动物通过不对称分裂维持自稳定性。,如：果蝇的,Insc,基因是感官前体细胞的不对称分裂的调控基因之一,，,通过三个途径进行调控：,不对称分配质膜上的,细胞定向决定因子,。,不对称分配细胞内的,mRNA,。,决定细胞分裂时,纺锤体的取向,。,5,哺乳动物的种群不对称分裂。,(1),种群不对称分裂,：,哺乳动物有几种不同的,干细胞群,，分裂后产生不同细胞。,干细胞,分化细胞,干细胞,干细胞,祖细胞,3,分化细胞,祖细胞,1,分化细胞,祖细胞,2,分化细胞,(2),哺乳动物种群不对称分裂的意义,：,使机体对干细胞的调控更灵活，以适应机体的生理变化。,要求机体对干细胞分裂的调控更精确，以保持干细胞数目恒定。,如：正常肠腺有,250,个细胞组成，如果额外多一个干细胞，则可能多产生,64128,个子代细胞。,(3),哺乳动物种群不对称分裂的调控。,哺乳动物通过多层次多角度调控，保持自稳定性。,正调控,：促进与细胞增殖、生存有关的基因表达。,负调控,：促进与细胞凋亡有关的基因表达。,如转基因小鼠,长期造血干细胞,高表达,Bcl,-2,后，使长期造血干细胞的数目显著增加。说明细胞凋亡也是干细胞的调控方式。,三、干细胞的分化特征,（一）干细胞的分化潜能,根据其分化潜能大小，干细胞可分为三类。,全能干细胞,多能干细胞,专能干细胞,1,全能性干细胞,(,胚胎干细胞,),：,具有形成完整个体的分化潜能。,如胚胎干细胞,(,ES,),具有很强的分化能力，可无限增殖并分化为全身,200,多种细胞类型，及机体的各种组织、器官。,(,图 全能干细胞,),2,多能性干细胞,：,多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。,如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。,(,图 多能干细胞,),3,专能性干细胞,(,成体干细胞,),：,专能干细胞,(,也称单能、偏能干细胞,),，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。,如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞,(,卫星细胞,),。,(,图，表皮干细胞,),(二),干细胞的转分化和去分化,1,干细胞的转分化,：,一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞的过程称干细胞的转分化。,实验：,C57BL/6J,成年小鼠,造血干细胞,WBB6F/J-,Kit,W,/,Kit,W,-V,鼠,(,亚致死剂量同位素照射,),在,鼠,的神经胶质细胞中检测到,Y,染色体,.,即,鼠,的,造血干细胞移植到,鼠,中分化为脑星形胶质细胞。,移植,分离,3天,2,干细胞去分化,：,一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称干细胞去分化。,实验：,成体鼠造血干细胞 鼠卵泡的内细胞团 表达胎鼠的珠蛋白基因参与胚胎造血系统的发育。,注入,分化状态逆转,3.,干细胞的可塑性,(1),干细胞的横向分化,：,在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为,与其组织来源一致的细胞,。但有时供体干细胞会分化出,与其组织来源不一致的其它细胞,，这种现象称,干细胞横向分化,(,trans-differentiation),。,干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗提供了可能。,(2),实验,：,小鼠肌肉干细胞体外培养,5,天少量骨髓间质细胞 接受致死量辐射的小鼠中,各种血细胞系。,植入,分化,(3),横向分化的调控机制,：,与干细胞的微环境有关。,干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。,四、干细胞增殖与分化的微环境,干细胞巢,(,stem cell,nich,),：,干细胞在组织中的居所。,干细胞生存的微环境,：,指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化的,外部信号,。,如：,这些物质可以介导干细胞-干细胞的相互作用，以及细胞与细胞外基质的作用，影响干细胞的增殖和分化。,细胞分泌因子,细胞表面的粘附分子,细胞外基质成分,（一）分泌因子,分泌因子是由细胞自分泌或旁分泌的生长因子，有的分泌因子对维持干细胞的增殖，分化和存活具有调节作用。,如,转化生长因子,-,和,Wnt,家族的成员，在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用。,1,转化生长因子,TGF,(,t,ransforming,g,rowth,f,actor,),是,TGF,超家族的成员之一，具有调节细胞生长和分化的作用。,因为,TGF,能使正常成纤维细胞的表型发生转化，即在,EGF,同时存在时，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去密度依赖的抑制作用，故命名。,TGF,的作用,：,TGF-,对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。一般对,间充质起源,的细胞起,刺激,作用，而对,上皮或神经外胚层来源,的细胞起,抑制,作用。,如,TGF-,家族成员,Dpp,可维持果蝇雌性生殖干细胞的增殖。,2,Wnt,家族的分泌信号分子,(1),Wnt,基因,：,Wnt,基因最初是在小鼠乳腺癌克隆出来的原癌基因，因病毒基因在其旁边插入可激活该基因，称为,Int,基因,，后发现其与果蝇的,无翅基因,(,Wingless,wg,),高度同源，故合称为,Wnt,基因,。,(2),Wnt,信号分子,：,是,Wnt,基因编码的长度为,350,400,个氨基酸的分泌型糖蛋白。它与,细胞表面,及,细胞外基质,有联系，在小范围内,(,几个细胞直径,),起,信使,的作用。,(3),Wnt,信号途径,：,是由,Wnt,参与的将信号由细胞表面传至细胞核内的信号传导途径。,主要包括,Wnt,信号蛋白,，,跨膜受体,(,Frizzled,),，,辅受体,LRP,(,低密度脂蛋白受体有关的跨膜蛋白,),、,Dishevelled,、,糖原合成酶激酶,3,(,GSK3),、,APC,、,Axin,、,-,连环蛋白,及,T,细胞因子/淋巴结增强因子,(,TCF/LEF),家族转录调节因子等。,(4),Wnt,信号途径的作用,：,在生物的正常发育中起重要作用，是组织发育、分化所必需的关键信号通路。,(5),Wnt,信号途径的作用机理：,通过,TCF/LEF,和,-cat,对,C-,myc,的表达进行调控，即,Wnt,通路的靶基因为,c-,myc,。,TCF/LEF,是,Wnt,信号通路的,中间介质,，,可与,-,连环蛋白,(,-,catenin,，,-cat),结合成复合物，将,-,catenin,由胞浆核内,。,-,c,at,是,Wnt,信号通路中最重要的信号分子。,-,cat,具有两种功能：,细胞粘附,及,信号转导,，其,C,-端参入信号转导，,N,-端参入细胞粘附。,正常情况下，,APC、GSK-3、,Axin,等调节下，胞浆内,-,catenin,处于平衡状态,；,当,Wnt,因子,与其受体结合，,Wnt,信号传导使,GSK3,被抑制，,使,-,catenin,不能正常水解而,积累,，过量的,-,catenin,与,Lef,/,Tcf,结合并入核，,与,DNA,结合蛋白,Tcf3,结合，激活,c-,myc,、,cyclinD1,等基因转录，促进细胞增殖分化。,如,Tcf,/,Lef,转录因子家族,对上皮干细胞的分化：,Tcf,/,Lef,与,-,Catenin,形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。,（二）受体介导的细胞,-,细胞相互作用,如果蝇的,Notch,基因产物,Notch,受体。,Notch,的配体为,Delta,基因产物，两者均为细胞表面跨膜蛋白。两者结合后在果蝇,刚毛器,的发育中起调节作用的蛋白质。,(,图，果蝇刚毛,),Notch,受体,果蝇的每个刚毛器由一个,神经前体细胞,发育成，而,神经前体细胞,又是从含多个神经原细胞的细胞群分化出来的，这种有选择地发育过程，依赖于,Notch,和,Delta,的基因调节。,Notch,与其配体,Delta,结合后，通过细胞间相互作用，向细胞核传递抑制信号，对相邻细胞,侧向抑制,，只使某个神经原细胞获得较强的竞争能力，被选择发育为神经前体细胞。,即当,Notch,与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当,Notch,活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。,(三),胞间基质和整合素,1.胞间基质：,即,细胞外基质，,指分布于细胞外空间，由细胞分泌蛋白和多糖构成的网络结构。,2.作用：,细胞外基质可以将细胞粘连在一起，同时还提供一个细胞外网架维持组织结构，通过结合与传递信号分子对细胞存活、增殖、分化、迁移等具有重要影响。,3.,细胞外基质的种类：,胶原,氨基聚糖,蛋白聚糖,层粘连蛋白和纤粘连蛋白,弹性蛋白,细胞粘连分子,举几个与干细胞增殖分化有关的例子。,(1),胶原,胶原是细胞外基质中的主要框架结构。,目前发现的胶原至少,19,种。每种胶原的结构特性均与其特定功能相适应。可形成胶原纤维,(,、,、,型,),、三维网络结构,(,型,),的片层胶原。,胶原是构成,基底膜,的主要成分之一，并与细胞基质中的其它成分一起构成,结构与功能的统一体,。为干细胞生存及生命活动提供微环境。,(2),层粘连蛋白,(,laminin，LN),层粘连蛋白,是基膜的主要功能成分。也是胚胎发育中出现最早的细胞基质成分。,在成体，它存在于上皮下和内皮下紧靠细胞的基底，以及肌细胞和脂肪细胞周围等。,层粘连蛋白的功能：,作为基膜的主要结构成分，促进基膜组装，介导细胞粘着胶原进而,铺展，促进生长,增殖；,诱导细胞分化，是个体发生中出现最早的细胞基质。如成肌细胞分化为肌细胞、间质细胞分化为肾细胞、上皮细胞等。,(3),纤粘连蛋白,(,fibronectin，FN),纤粘连蛋白,分,血浆,FN,和,细胞,FN,。,血浆,FN,存在于血浆及各种体液中；,细胞,FN,存在于细胞外基质,(,包括某些基膜,),及细胞表面。,细胞,FN,为多聚体，有,20,种以上。是同一基因的编码产物，转录后由于,RNA,拼接不同形成多种,异型分子,，,拼接方式,依细胞类型及发育状态而定，从而使细胞产生适合组织需要的,FN,形式。,即细胞通过控制,FN RNA,的,拼接方式,，使其,与不同细胞结合,及产生特异效应。,FN,的功能,：,主要是介导细胞粘着，以此,调节细胞形状和细胞骨架的组装，促进细胞铺展,、迁移,，并可通过迁移途径决定细胞的分化方向。,如沿富含,FN,途径迁移的神经脊细胞最终分化为肾上素能神经元，形成神经节,。,4.,整合素,(1),是一种通过识别并结合相邻细胞的粘附分子和细胞外基质成分，,介导细胞,-,细胞,以及,细胞,-,细胞外基质间,的相互作用的,受体蛋白质,。属于细胞粘连分子。,(2),整合素对干细胞的作用,：是促进干细胞的非分化增殖。,(3),作用机理：,作为,细胞外基质的受体,，与配体结合后，启动胞内,信号传递,的连锁反应，最终影响基因表达，为促进干细胞的,非分化增殖,提供微环境。,将干细胞置于组织中的,正确位置,，使干细胞维持非分化性增殖。,整合素是由,和,两个亚单位形成,异二聚体,。已发现有,16,种,和,9,种,亚单位，可组合成,20,余种整合素。,与细胞外基质成分结合的整合素主要以,1,与,9,种,亚单位分别构成的异二聚体。,如当,1,丧失功能时，上皮干细胞脱离微环境制约，分化成角质细胞。,即细胞外基质通过调节,1,整合素的表达和激活，影响干细胞的分布和分化方向。,(4)整合素对干细胞的影响作用过程：,需,2,步：,一是整合素活化；,二是活化的整合素作用于干细胞。,整合素活化：,整合素通常不与配体结合，需要经过活化。活化因素是外部信号的刺激，活化过程为,胞内信号外传,过程。,胞外信号,刺激,引起胞内变化,变化信号,于整合素的胞质部分,活化,细胞外识别与结,合结构域。,作用,整合素对细胞的作用：,作用过程为,胞外信号内传,：,整合素活化后与配体,(,如纤粘连蛋白,),结合,细胞内细胞发生反应。,如粘着斑蛋白与骨架系统的组装，激酶磷酸化等，使细胞发生分泌、增殖、分化、迁移等。,信号传导,活化的整合素又可失活，使粘附的细胞彼此脱离。,即整合素通过与细胞外基质的,弱结合,，使细胞在不脱离粘附的情况下根据微环境，通过可逆性的,结合与解离,进行细胞迁移。,第二节 胚胎干细胞,1,胚胎干细胞,：,从囊胚期,(,受精后,57,天,),胚胎分离到的干细胞称胚胎干细胞。,2,胚胎干细胞的特性,：,为全能性干细胞,。有如下,特性,：,可在体外无限增殖并保持未分化状态。,具有分化为完整个体的潜能。,具有分化为所有种类的细胞、器官的潜能。,3,胚胎干细胞的研究价值：,是,发育生物学,基础研究的理想模型和有效工具。,(,图，胚胎干细胞的应用,),研究细胞分化,研究基因功能,研究基因表达,一、,人胚胎干细胞的获得,要研究胚胎干细胞，首先要获得胚胎干 细胞。,(一),获得途径：主要有：,从早期胚胎获得,2.从原始生殖细胞获得,3.从移植细胞(克隆细胞)获得,1,从早期胚胎获得,美国,Thompson,研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：,体外受精卵 囊胚期 去除滋养层内细胞团 得,5,株干细胞系,32,代,(8,个月,),保持未分化状态。,传代,培养,发育,免疫切除法,2,从原始生殖细胞获得,gearhart,小组：,流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞,获得,5,个多能干细胞系,7,个月不分化。,(,图，干细胞获得,),思路：原始生殖细胞是未分化细胞。,培养,分离,培养,3,体细胞移植,分化细胞核,(,乳腺、皮肤细胞,),去核卵细胞杂合细胞 发育成囊胚,胚胎干细胞 成体,(,如多利羊,),。,(,图，体细胞获得干细胞,),分离,发育,移植,刺激,二、胚胎干细胞的主要特征,（一）形态和生化特征,1.,形态,：细胞体积小，核大，,1,多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。,2.,生化特征,：,端粒酶活性高,。,3.,干细胞物理特性,：,如干细胞对,Hoechst33324,和,Rhodamine,123,染料不着色。,4.,干细胞表面免疫原性,：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。,如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原,-1(,SSEA-1)，,不表达,SSEA-3,或,SSEA-4；,人胚胎干细胞表达,SSEA-3,或,SSEA-4。,(,二,),干细胞的分离与纯化,1.,借助细胞的,生化特征及物理特性,，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。,2.,干细胞的理化特征与其,分化调控,有关，如上皮干细胞高表达,1,整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。,(三),干细胞的体外培养,由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。,不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。,1,培养条件：,需要许多,生长因子,和,间质细胞,的共培养。,如,Brustle,等在体外培养了鼠的,ES,细胞。,分离,ES,细胞 培养 培养,生长增殖 保持分化潜能。,停止供给生长因子，,ES,细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。,EGF,培养基,FGF,2,+,PDGF,FGF,2,培养基,2,分化诱导,在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。,分化诱导需了解：,干细胞发育有关的信号调节；,干细胞发育的微环境。,（四）胚胎干细胞的分化潜能,胚胎干细胞是全能,(,多能,),性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。,实验,1：,移植实验,人胚胎干细胞 小鼠体内 畸胎瘤,(,良性,),有三个胚层产生的组织：,移植,发育,胃上皮(内胚层),骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层),神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层),三、胚胎干细胞研究的伦理挑战,胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方面遇到很大的障碍。,避孕、流产和体外授精在西方国家引起很大争议。,(,一,),存在的问题,1.,胚胎干细胞的来源是否符合法律与道德？,2.,胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法律问题？,3.,该项研究是否会导致人流泛滥？或导致医生刻意造成胚胎流产？,4.,如何看待克隆人的研究？,（二）反对人的观点,1.,认为胚胎干细胞研究破坏人类生命，其观念基于人类生命起始于早期胚胎。,2.,天主教派极力反对胚胎干细胞研究，认为用人类胚胎干细胞进行研究是一种“邪恶”。,(,三,),支持者的观点,科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项研究。,2001,年,4,月，,James,Watson,博士,(,DNA,双螺旋结构发明人、冷泉港实验室主任,),倡导发起了由,80,位诺贝尔奖获得者参加的签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。,(,四,),西方政府的态度,1,美国总统布什,(1),当选总统前反对，当选后出于政治目的，同意政府,有限支持,。,2001,年,8,月,9,日，布什作出决定，美国政府资助对,2001,年,8,月,9,日前,得到的人体胚胎干细胞研究，但,不支持从新的胚胎中获取干细胞,的研究。,(2),同时，布什提出成立一个由,科学家、医生、伦理学家、律师、神学家,等组成的,总统生物伦理专家委员会,，指导干细胞的研究和管理。由芝加哥大学生物伦理学教授,Leon,Kass,担任主席。,2,美国国立卫生研究院,(,NIH,),(1),美国国立卫生研究院是美国联邦政府支持干细胞研究的主要机构。,(2),NIH,的年度经费为,204,亿美元，,2000,年投入干细胞研究,2.26,亿美元，其中用于人体成年干细胞研究为,1.41,亿美元。,(3),根据布什的决定，,NIH,对现存人体胚胎干细胞系进行登记，认定世界上有,64,个人体胚胎干细胞系,符合联邦政府资助的标准。,(4),64,个人体胚胎干细胞系分布在,6,个国家的,10,个机构,中：瑞典,24,个，美国,20,个，印度,10,个，澳大利亚,6,个，以色列,4,个。,NIH,试图用这些人体胚胎干细胞系完成有关人体胚胎干细胞的基础研究工作。,3,其他国家的态度,(1),德国禁止,利用人体胚胎干细胞进行研究。,(2),澳大利亚,开始仿效美国的作法，,有限支持,人体胚胎干细胞的研究。,(3),法国、英国、日本,允许利用,多余的胚胎,和,SCNT,技术创造的胚胎进行干细胞研究。,第三节 精原干细胞,精原干细胞来自,原始生殖细胞。,胚胎外胚层 原始生殖细胞 双侧生殖腺嵴 生精索,(,曲细精管,),生精母细胞,(,精原干细胞的前体细胞,),成体精原干细胞,分化,分化,迁移,发育,形成空隙,sertoli,前体细胞,一、精原细胞的增殖和干细胞的再生,1,精原细胞的形态特征：,精原细胞紧贴于曲细精管的基膜，圆形或卵圆形，,12m,，,核大，除核糖体外其它细胞器不发达。,2,精原细胞的增殖与类型：,精原细胞分为,A,型和,B,型。,A,型：,常染色质丰富，核仁常靠近核膜，根据在曲细精管局部的排列特征，又分为,A,single,、,A,paired,和,A,aligned,三种类型,。,B,型,：分化型精原细胞。,精原干细胞的类型与增殖分化：,A,single,(A,s,),分裂,自我增殖,同步分化,2个,A,s,2个,A,pr,精子,维持干细胞数量,A,paired,(A,pr,),分裂,4、8或16个,A,al,A,aligned,(A,al,),分化,分裂,A,1,A,2,A,3,中间型,分裂,分裂,分裂,A,4,分裂,B,型精子,A,型,精子,B,型(分化型),有丝分裂,初级精母细胞,减数分裂,其中,A,pr,型,即是进入,精子分化的第一步,。,A,1,型,标志精原细胞开始定向分化。,B,型标志精子开始形成,。,二、精原细胞的分化及其控制,1,分化,A,al,型精原细胞,A,1,型 精子,A,1,型精原细胞,是精子形成的不可逆的,调控点,。机体对这一调控点有相当严格的控制。,分化,分化,2,分化控制,(1),精原细胞分化抑制的影响因素：,动物模型研究表明，精子发生存在可逆性抑制，使,A,1,型精原细胞不分化而增殖。,其影响因素如,sertoli,细胞的中毒、辐射损伤、维生素缺乏甚至睾丸温度升高等。,(1),细胞毒性药物致分化抑制,sertoli,细胞毒性药物,2，5-,己二酮,小鼠,A,1,型精原细胞不能分化。,用,促性腺激素释放激素,的,激动剂,治疗后，药物导致的分化抑制得以缓解。,说明激素水平可以调节生殖细胞的分化。,作用5周,(2),Kit,受体的作用,Kit,受体,：即干细胞生长因子受体。属于生长因子受体类的原癌基因产物。,作用,：,原始生殖细胞,表达,Kit,受体，,sertoli,细胞分泌干细胞因子,(,SCF),。,SCF,通过与,Kit,受体结合,促进细胞增殖,。,干细胞因子：,有两种形式,在已二酮,(,hexanedione,),导致,精子发生衰退,的大鼠中，,sertoli,细胞表达,可溶性因子,，经激素,治疗,后，,膜包被型数量增加,。表明,Kit-SCF,在精原细胞分化中的作用。,可溶型 促进增殖,膜包被型 促进分化,(3),VitA,的作用,VitA,缺乏精细胞退化，补充,VitA,或维甲酸分化重新开始,推测：,A,型精原细胞中有维甲酸的核内受体，因此维甲酸对,A,型精原细胞有作用，但这种作用依赖,sertoli,细胞。,三、精原细胞的凋亡,精子发生过程中通过细胞凋亡调节分化型精原细胞的密度。,分化型精原细胞在曲细精管不同部位差别很大，但原始生殖母细胞密度变化很小，是因为,分化型的精原细胞在不同部位选择性地凋亡。,精子发生过程中的凋亡相关基因,凋亡促进基因,：,ICE(IL-1-converting aenzyme),bax,p53,ICH-1，fas,等,。,凋亡抑制基因,：,bcl-2,crmA,等,。,（一）,Bcl-2,家族,1.bcl-2,基因,bcl,-2,基因：,是,1985,年发现的一个,原癌基因,，与,Ced,基因有,23%,同源性。,Bcl,-2,蛋白：,bcl,-2,基因编码,26,kd,的膜蛋白，存在于线粒体、核膜、内质网膜上。,生理功能,主要是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，对细胞增殖率和分化不产生影响。,2.Bcl-2,家族,(1),Bcl,-2,家族：,Bcl,-2,家族包括,Bcl,-2,结合蛋白,和,Bcl,-2,同源蛋白,，它们在结构上有同源性，共同具有,2,个保守区域：即,Bcl,-2,同源区,BH1,和,BH2,区段,，功能相关，即诱导或抑制细胞凋亡。,这些蛋白包括,Bcl,-2,、,Bcl,-,xL,、,Bcl,-,xs,、,Bax,、Bad、Bad-1,以及线虫的,CED-9,等。,(2),Bcl,-2,家族在细胞内存在形式,：,由于它们的同源结构，可以形成同源二聚体或异源二聚体。如：,同源二聚体,Bcl,-2-,Bcl,-2,；,异源二聚体,Bcl,-2,-,Bax,。,(3),Bcl,-2,蛋白家族主要成员及生理功能,：,Bcl,-2,：抑制细胞凋亡,Bax,：诱导细胞凋亡,bcl,-x：,通过,mRNA,不同剪切形成两种蛋白，,Bcl,-,xl,和,Bcl,-,xs,。,Bcl,-x,l,和,Bcl-2,结构同源，抑制细胞凋亡；,Bcl-xs,诱导细胞凋亡。,3.Bcl-2,抑制凋亡的机制,Bcl,-2,抑制凋亡作用是通过与促凋亡基因,Bax,形成,异源二聚体,来实现。,(1),Bcl,-2、,Bax,和,Bcl,-X,的凋亡控制系统：,Bax,同源二聚体,Bax,-,Bax,，诱导凋亡；,Bcl,-2,与,Bax,形成,Bcl,-2-,Bax,异源二聚体，结构比,Bax,-,Bax,同源二聚体更稳定，可“中和”,Bax,-,Bax,二聚体诱导凋亡的作用。,即细胞内,Bcl,-2,与,Bax,的表达水平调节细胞生存或凋亡。,当,Bcl,-,xs,存在时，优先与,Bcl,-2,形成异源,Bcl,-,xs,-,Bcl,-2,二聚体，而使游离的,Bax,得以形成同源二聚体，诱导凋亡发生。,此时,Bcl,-2,表达并不抑制细胞凋亡。,(2),Bcl,-2,家族蛋白抑制凋亡的分子机理：,Bcl,-2,家族蛋白形成异源二聚体，是依赖其同源结构域,BH,1,和,BH,2,。当,Bcl,-2,中,BH,1,和,BH,2,区域的特定氨基酸被转换后，不能与,Bax,形成二聚体，而自身形成同源二聚体,Bcl,-2-,Bcl,-2,，,其抑制凋亡的功能丧失。,(3),精原细胞中的,Bcl,-2,家族,精原细胞不存在,Bcl,-2,，但在,Bcl,-2,转基因小鼠中，局部高密度诱导的精原细胞凋亡消失。,说明虽然,Bcl,-2,蛋白本身并不参与，但其家族成员控制着精子发生过程。即,Bax,和,Bcl,-X,的表达和作用平衡控制精原细胞的密度相关性调亡。,睾丸中表达,Bcl,-X,基因,有两种变异体,Bcl,-Xs,和,Bcl,-,Xl,，前者促凋亡，后者抑凋亡。,Bax,基因,是控制精原细胞凋亡的重要因素。,剔除,Bax,基因,小鼠,无生育能力,，其睾丸组化特征与,Bcl,-2,和,Bcl,-,Xl,转基因小鼠相似，都表现出,精细胞的聚集,。,（二）,P53,蛋白,1,P,53,蛋白是由,p53,基因编码的由,393,个,aa,构成的核磷蛋白。在许多组织中有表达，特别是在胸腺、脾、睾丸和卵巢中表达量很高。,p53,基因位于,17,q13,。,2,p,53,蛋白的生物学功能,(1),p,53,蛋白与细胞中,DNA,损伤：,DNA,损伤严重,p,53,蛋白表达水平急剧增加细胞停止在,G,1,期，等待细胞对,DNA,进行修复。,即,p,53,通过监视,DNA,的忠实性和稳定性而调节细胞增殖，防止肿瘤发生。,(2),p,53,蛋白与细胞周期的控制：,野生型,p,53,可以阻止细胞转化，抑制细胞成瘤能力。,p,53,是一个转录因子类的蛋白，可以促进细胞内某些基因的表达。如,GADO-45,，,mdm,-2,和,p,21,基因。,p,53,蛋白抑制细胞分裂的功能很可能与促进,p,21,基因表达有关，因为,p,21,蛋白是细胞周期促进因子,CDK,的抑制剂。,p,21,蛋白可通过与,CDK,结合而抑制,CDK,的激酶活性，从而使细胞停止在,G,1,期。即,p,53,蛋白在细胞内通过促进,p,21,基因的表达而抑制细胞周期。,(3),P,53,蛋白与癌蛋白的作用：,P,53,蛋白可被癌基因产物结合而失活。,(4),P,53,蛋白对细胞凋亡的作用：,P,53,蛋白水平增加可使有些类型的细胞发生凋亡，其机制之一就是当细胞中,DNA,损伤太严重时，细胞自身难以修复，选择凋亡以保证器官功能正常。,3,P,53,蛋白与精原细胞凋亡,(1),p,53,缺陷型,小鼠睾丸中,A,1,型精原细胞,比野生型小鼠,多,50%,。,p,53,缺陷导致,A,1,型精原细胞多的,2,种原因,：一是正常,p,53,蛋白参与不分化精原细胞的周期调节，二是正常,p,53,蛋白可诱导这些细胞凋亡。,(2),p,53,缺陷型小鼠细线期精母细胞的数量与野生型小鼠相近，说明,p,53,缺陷型小鼠仍能精确控制精原细胞分化水平。,第四节 成体干细胞,成体组织或器官中，许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血液细胞、皮肤细胞、受损的肝组织细胞等。这些细胞即是成体干细胞.,一、造血干细胞,造血干细胞是第一种被认识的组织特异性细胞。,1961,年,Till,和,McCulloch,首次通过小鼠脾集落形成实验证实造血干细胞在成体内的存在。,1,形态：,一般认为造血干细胞的形态类似小淋巴细胞。,2,细胞表面标志：,表面标志比较多，临床上应用最多的是,CD34,。,还可与,KDR,(,kinase,insert domain,recepter,),配合鉴定造血干细胞和造血祖细胞。,造血干细胞：,CD34,+,KDR,+,造血祖细胞：,CD34,+,KDR,-,实验,：,Zieglar,用致死剂量照射小鼠后进行细胞移植实验。,植入,致死剂量照射小鼠,骨髓,CD34,+,外周血,CD34,+,KDR,+,脐血,CD34,+,KDR,-,死亡,成活,死亡,说明造血干细胞,CD34,+,KDR,+,，而造血祖细,胞,CD34,+,KDR,-,。,3,造血干细胞的胚胎发生,中胚层细胞 造血环境,(,大动脉、性腺脊、中期肾区,),胎肝 髓系及淋巴系的前体细胞 骨髓,迁移,出生前迁移,迁移,分化,4,造血干细胞的调控,(1),维持造血干细胞的数目恒定：干细胞因子,(2),影响干细胞的移行、数目维持、分化：成纤维细胞生长因子,(,FGF-1，FGF-1,),、SDF-1,、,细胞外基质。,二、间充质干细胞,(,mesenchymal stem cell，MSC),1,间充质干细胞的位置,间充质干细胞附着于骨髓窦的内腔面，形成 一种包埋于窦状网络中的三维细胞网络。,(,图，间充质干细胞,),2,MSC,的分离与表面标志,(1),分离：,骨髓抽提物取,1.073/,ml,密度界面上的细胞，贴壁生长的细胞中,9598%为,MSC。,根据细胞表面抗原获得,MSC,。,(2)MSC,的特异性表面标志,通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：,SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124,。,3,间充质干细胞的分化方向,间充质干细胞可分化为多种间充质组织。如骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质等。,来源不同或在不同条件下，间充质干细胞可分化相应组织细胞。,如骨髓中的间充质干细胞可分化,脂肪细胞,、,软骨细胞,和,成骨细胞,。,在含有,1,-,甲基,-3-,异丁基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛的培养基中，,95%,间充质干细胞分化为脂肪细胞。,在含,TGF,-,3,的无血清培养基中，间充质细胞会分化为软骨细胞。,由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨细胞、软骨细胞，可在,骨损伤,、,先天性骨畸形,有治疗中有广泛应用。,三、神经干细胞,传统观点,：神经细胞无再生能力。,新发现,：中枢神经系统中部分细胞仍具有自我更新及分化产生成熟脑细胞的能力，这些细胞被称为,神经干细胞,。,1,神经干细胞的存在部位,哺乳动物,中脑侧室,的,室管膜下区,包括,室管膜,的细胞中存在有增殖能力的干细胞。,成体的下脑室区、嗅球及海马区是神经干细胞存在的部位。,1992,年,Rynolds,和,Weiss,首先从成体小鼠脑旁侧室膜下的神经组织中分离并培养了神经干细胞。,Svendsen,等用同样的方法从人的胚胎中分离出神经干细胞。,神经干细胞持续分裂每周传代一次，可维持一年以上。,2,神经干细胞的生化特性,神经干细胞表达,巢素蛋白，所有的神经干细胞都巢素蛋白阳性。,巢素蛋白的表达始于神经胚形成期，当神经细胞迁移基本完成后，合成开始下降，神经细胞完成分化，巢素蛋白表达停止。,3,神经干细胞的维持与分化,(1),促进细胞增殖的因素：,表皮生长因子,(,EGF)，,成纤维细胞生长因子-,2(,FGF-2),，,对干细胞的存活、增殖和分化起重要作用。,EGF,的主要作用是维持神经干细胞,生存,；,FGF-2,主要是以对细胞,分化,起作用。,(2),促进神经干细胞分化的因素：小牛血清。,用小牛血清替代,EGF,培养神经干细胞，细胞,分化,为星形胶质细胞、少突状细胞和神经元；巢素蛋白逐渐减少，出现神经元特有的微管结合蛋白,2,及胶质细胞的特征性神经胶质原纤维酸性蛋白。,四、表皮干细胞,1,表皮干细胞的存在部位,(1),表皮干细胞位于表皮基底层,。属于,专能干细胞,。能周期性的进入分化程序，最终分化为角质细胞。,(2),表皮增殖单位,：位于基底层的干细胞和分布在它周围的由它分裂形成的子细胞，共,9,个，组成一个柱状细胞群，称为一个表皮增殖单位。,(3),表皮干细胞的分化：,表皮增殖单位,边缘的,子细胞,脱离基底膜后向上迁移经过,棘细胞层,和,颗粒层细胞,，最终形成,角质化无核细胞,。这层细胞不断脱落，由新生的细胞不断补充。,人体不同部位的皮肤更新速度约,24,周。在细胞迁移过程中，角质化伴随着分化过程。,2,毛囊干细胞,毛囊组成,：由外根鞘、内根鞘和发干组成。,毛囊球：包括间充质细胞,(,团,),构成的毛乳头和基质细胞。,基质细胞：产生内根鞘和发干的活跃分裂细胞称为基质细胞。是存在于毛囊球中的一群可分裂的上皮细胞。,毛乳头中的间充质细胞即是毛囊干细胞。,毛囊干细胞需在毛囊的膨胀部位进行增殖。当基质细胞失去增殖能力时，毛囊退化，拉动毛乳头细胞团进入膨胀部位，毛乳头细胞团接受信号刺激后，膨胀部位的干细胞增殖产生新的毛囊。,毛囊中的干细胞同样可以产生表皮，尤其在外伤或烧伤后能重建表皮毛发。,3,表皮干细胞的生化标志,(1),表达角蛋白,5(,keratin 5，K5),和,K14,分子：同角细胞相同。产生的角蛋白在成熟皮肤细胞中形成中间网络，使表皮细胞形成一个整体，并具有韧性。,表达整合素,：,与,型胶原和纤维粘合素粘附。以这种方式与基底膜相连。当这种粘附力下降时，干细胞易从干细胞巢脱落，向表皮分化。,干细胞高表达整合素和粘附素，在维持干细胞增殖和存活的信号传导途径中发挥重要作用。,毛囊干细胞的增殖潜能非常大，体外一单独的毛囊干细胞在合适的条件下产生的子细胞数多达,1.710,38,，大大超过了覆盖整个成体体表所需的细胞数。,五、肠干细胞,1,肠干细胞的位置,肠表面由被肠腺围绕并根植于肠壁的绒毛组成，每一肠腺大约有,250,个细胞，其中有肠干细胞，位于肠腺的基部或近基部。,2,肠干细胞的增殖与分化,小肠绒毛上皮细胞的更新是从隐窝底部的干细胞分裂开始。,分裂成的一个子细胞保持增殖能力，返回增殖池，另一个子细胞向上迁移，并逐渐失去分裂能力，分化为上皮细胞，至绒毛顶部死亡脱落。,肠干细胞增殖缓慢,(,Tc,24,小时,),过渡放大细胞,(,Tc,=11,小时,),迁移并分化死亡落入肠腔。,3,肠干细胞的生化特征与分离,(1),肠干