微生物杂交育种.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 微生物杂交,杂交的意义,微生物杂交育种基本程序,杂交过程中亲本和培养基的选择,杂交育种的遗传标记,杂交育种方法,1.,独特优点,(1),通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。,(2),通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。,(3),通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。,1.1,杂交的意义,2.,微生物杂交的本质和方式,(1),本质,基因重组（体外）,(2),方式,细菌和放线菌等原核生物：两个亲本菌株细胞间接合，染色体部分转移，形成部分结合子,(merozygote),，最后经交换、重组直至重组体的产生。,真菌：通过有性生殖或准性生殖来完成。,1.1,杂交的意义,1.,营养缺陷型标记,2.,抗性标记,3.,温度敏感性标记,4.,其他性状标记,1.4,杂交育种的遗传标记,1.,常规杂交育种,2.,原生质体融合育种,1.5,杂交育种方法,第二节 细菌杂交育种,细菌繁殖和遗传结构,细菌杂交的概况和原理,细菌杂交方法与技术,2.1,细菌繁殖和遗传结构,结构,:,单细胞、拟核、,1,条环状染色体、质粒,菌落,:,母细胞为中心的一堆肉眼可见的有一定形,态构造的子细胞集合体。,繁殖：,裂殖：,二分裂,：横,纵,均,不,三分裂,：,三维网格状含之,复分裂,：,蛭弧菌类,芽殖：,芽生细菌,;,芽生杆菌属,;,生丝微菌属,;,生丝单胞菌属,;,硝化杆菌属,;,红微菌属。,1.,细菌接合与,F,性因子,2.2,细菌杂交的概况和原理,F,菌株：,无,F,因子。,F,菌株：,有,F,因子。,Hfr,菌株：,F,因子的,DNA,嵌入染色体,DNA,中。,F,菌株：,由不正常切割形成特殊,F,因子，携带有小段染色体基因,2.2,细菌杂交的概况和原理,2.,大肠杆菌杂交与菌株类型,Hfr,菌株与,F,菌株,结合过程,F,菌株的形成,2.2,细菌杂交的概况和原理,2.,大肠杆菌杂交与菌株类型,由不正常切割形成,携带有小段染色体基因,1.,杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得,(1),杂交亲本菌株选择,(2),标记菌株,(3),性别菌株的获得,2.,杂交的方法,(1),直接混合法：细菌杂交一般采用。,(2),反选择标记：检出重组体。,(3),非选择性标记：,2.3,细菌杂交方法与技术,第三节 放线菌杂交育种,放线菌细胞结构与繁殖,放线菌杂交概况和原理,放线菌的杂交技术,3.1,放线菌细胞结构与繁殖,三丝：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝,1.,放线菌杂交原理,3.2,放线菌杂交概况和原理,SCP,1,因子,（,1,）接合,2.,放线菌杂交过程,3.2,放线菌杂交概况和原理,（,3,）重组体,（,2,）杂合系,(heterochone),和重组体杂合系,2.,放线菌杂交过程,3.2,放线菌杂交概况和原理,主要杂交方法,3.3,放线菌的杂交技术,3.3,放线菌的杂交技术,放线菌杂交育种的一般程序,1.,混合培养法,（,1,）直接亲本是,杂交配对菌株,（,2,）斜面混合接种,（,3,）单孢子悬液的制备,（,4,）重组体的检出,（,5,）杂合系分析,3.3,放线菌的杂交技术,Met-,甲硫氨酸,Str-,抗性,Phe-,丙苯氨酸,2.,玻璃纸法,（,1,）玻璃纸法的原理,（,2,）玻璃纸平板杂交的具体方法,（,3,）分离子的检出和鉴别,3.3,放线菌的杂交技术,3.,平板杂交法,3.3,放线菌的杂交技术,第四节 酵母菌的杂交育种,一、酵母菌的细胞结构和菌落形态,单细胞真核生物,二、酵母菌的生活史和繁殖方式,有性杂交,三、酵母菌的杂交,(,一,),标记菌株的选择,(,二,),酵母杂交方法,1.,子囊孢子的制备：成份贫乏的生孢培养基,2.,杂交,第五节 霉菌杂交育种,霉菌的细胞结构和繁殖,霉菌杂交的原理和杂交技术,高产重组体的筛选,1.,霉菌细胞结构,2.,霉菌的繁殖,准性生殖,5.1,霉菌的细胞结构和繁殖,1.,异核体的形成与获得方法,异核体与同核体,异核体互补与喂养或互养,A.,选择直接亲本：亲合力与遗传标记,B.,异核体合成方法,(1),完全培养基的混合培养法,(2),基本培养基衔接法,(3),有限培养基培养法,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,(1),完全培养基的混合培养法,(2),基本培养基衔接法,(3),有限培养基培养法,1CM+9MM,2.,杂合二倍体的形成和检出,(1),杂合二倍体的形成和诱变,(2),杂合二倍体的表型,(3),杂合二倍体的检出：角变、斑点,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,3.,体细胞交换、分离和单倍化,（,1,）体细胞交换,（,2,）体细胞分离,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,（,3,）单倍化,（,4,）分离子,亲本分离子、原养型分离子、异养型分离子,二部体分离子、单倍体分离子、非整倍体分离子,（,5,）分离子的检出和测定方法,1.,杂交亲本选择，不仅要具有优良性状，而且最好是近亲配对组合；,2.,采用适合的诱变剂处理杂合二倍体，使其适应酶系统代谢调控；,3.,重组体在摇瓶筛选阶段，应做到条件和大生产条件尽量接近。,5.3,高产重组体的筛选,第六节 微生物原生质体育种,与正常细胞相比，原生质体具有的新特性：,1.,对外界环境影响更敏感，对诱变剂的诱变效应更强烈；,2.,破壁后细胞表面受体和噬菌体结合部位不复存在，失去对噬菌体的敏感性；,3.,不受感受态的影响，可进行原生质体转化和融合等基因重组。,一、微生物原生质体再生育种,1.,概念：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。,2.,原生质体再生育种比常规育种正变率高的原因：,(1),原生质体本身较为敏感；,(2),原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程，再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化；,(3),常规诱变育种选用材料多为孢子，对诱变剂较迟钝，制备原生质体的材料则为对数生长期细胞，对诱变剂敏感；,(4),原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的影响。,3.,原生质体再生育种的一般程序,出发菌株的选择菌种活化和预培养 原生质体制备原生质体再生高产菌株分离,(,初筛,),复筛遗传稳定性鉴定菌种特性及发酵特性研究。,4.,原生质体再生育种实例,二、微生物原生质体诱变育种,(,一,),原生质体诱变育种方法,1.,物理诱变剂诱变原生质体的一般程序,2.,化学诱变剂诱变原生质体的一般程序,(,二,),原生质体诱变育种实例,1.,扩展青霉,PF-868,原生质体制备,:,纤维素酶,2.,原生质体再生,3.,原生质体诱变,4.,突变株鉴定,三、微生物原生质体转化育种,四、微生物原生质体融合育种,五、其他微生物原生质体育种,第七章 微生物原生质体融合育种,与常规杂交相比，原生质体融合具有以下优势：,1.,大幅度提高亲本之间重组频率（,10,-1,）,2.,扩大重组的亲本范围（远缘间产生融合子）,3.,原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更大。,原生质体融合杂交的原理和融合程序,原生质体融合育种的主要步骤：,直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备与再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体分离,遗传特性分析与测定,一、直接亲本及其遗传标记选择,1.,直接亲本的选择,一般采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势,2.,遗传标记的选择,常用方法：带隐性性状的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。,灭活法：在实际工作中难以找到符合要求的标记菌株时，最好采用灭活，把双亲中任何一方的原生质体用热灭活或用紫外线、药物灭活，然后与另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。,新融合筛选方法：荧光标记法。,二、原生质体制备与再生,(,一,),原生质体制备,活性原生质体制备过程：原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。,细胞去壁与原生质体分离：,细胞去壁后，原生质体从中释放出来的过程为原 生质体分离。,去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法，其中最有效、最常用的是酶法。,酶法分离原生质体的主要步骤,1.,酶法分离原生质体的影响因素,(1),培养基组成,(2),菌体培养方式,(3),菌体菌龄,(4),稳定剂：高渗溶液,(5),酶解前的预处理：,Triton-100,、,EDTA,(6),酶系和酶的浓度：细菌溶菌酶,真菌蜗牛酶,(7),酶的作用温度和作用,pH,值,(8),菌体密度,(9),酶解方式,2.,原生质体的鉴定（分离程度）,(1),低渗爆破法,(2),荧光染色法（红光）,3.,原生质体的收集和纯化,(1),过滤法,(2),密度梯度离心法,(3),界面法,(4),漂浮法,4.,原生质体的活力鉴定,(1),荧光素双醋酸盐染色法（有荧光）,(2),酚藏花红染色法（红色）,(3),伊文思蓝染色法（无色）,5.,原生质体的保存：低温、液氮、,DMS,(,二,),原生质体再生,三个阶段：,大分子合成与原生质体生长阶段,细胞壁合成与再生阶段,分裂能力恢复并开始分裂繁殖成为正常细胞形态和菌落阶段,1.,原生质体再生的影响因素,(1),菌体生理状态,(2),稳定剂：高渗,(3),酶浓度和酶作用时间,(4),再生培养基组成,(5),残存菌体的分离,(6),原生质体密度,(7),再生培养基上的冷凝水影响：培养基出汗,(8),再生方法：双层平板法,2.,再生率及其计算,三、原生质体融合,(,一,),原生质体融合过程,霉菌：两亲株原生质体混合于高渗稳定液中,在,PEG,的诱导下，两个或两个以上凝聚成团,相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失,细胞质融合，形成一个异核体细胞,异核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体,通过染色体交换，产生各种融合子,(fusant),。,(,二,),原生质体融合的影响因素,1.,融合剂,化学融合剂：,PEG,，分子量,4000,6000,物理融合剂：电场和激光,2.,温度,3.,亲株的亲和力和原生质体的活性,4.,无机离子,5.,其他条件,四、融合体再生,(,一,),融合体再生,融合体再生包括：融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生，具体过程与一般原生质体再生相同。,(,二,),融合体的检出与分离,原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。,1.,利用营养缺陷型标记选择融合体,2.,利用抗药性选择融合体,3.,用灭活原生质体检出融合体,4.,利用荧光染色法选择融合体,5.,双亲对碳源利用不同而检出融合体,6.,融合体的其他选择方法,五、融合重组体检出与遗传特性分析,(,一,),重组体的检出和鉴别的方法,1.,直接法,2.,间接选择法,3.,钝化选择法,指灭活原生质体和具活性原生质体（营养缺陷型标记）融合。,(,二,),融合率,(,三,)DNA,含量及孢子形态测定,重组体的进一步鉴定,1.DNA,含量测定,2.,单倍化,3.,有关酶活性及孢子体积测定,4.,分子生物学方法,六、原生质体融合的应用,1.,提高产量或质量，合成新物质,2.,改良菌种遗传特性,3.,优化菌种发酵特性,4.,质粒转移,5.,原生质体与细胞核融合,6.,进行遗传分析,第八节 细菌原生质体融合育种,一、概述,1.,细菌类型和细胞壁特点,一、概述,1.,细菌类型和细胞壁特点,教程,21,页图,2-3,外膜蛋白,N-,乙酰葡糖胺（,G,）,N-,乙酰葡糖胺（,M,）,-,1,4-,糖苷键,肽桥,四肽尾,肽桥,G,+,G,-,稀疏的网套,2.,溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁的作用机制,二、细菌原生质体融合育种一般程序,三、细菌原生质体融合育种技术,(,一,),培养基与溶液,1.,常用培养基,2.,高渗溶液,(,二,),细菌原生质体融合育种,1.,提高细菌原生质体制备率和再生率的方法,(1),预处理：,EDTA,、表面活性剂,(2),溶菌酶,(3),细菌生理状态,(4),培养基组成与培养条件,2.,建立最佳融合体系,3.,重组子分离模型,(,三,),操作方法,1.,细菌原生质体的制备方法,2.,细菌原生质体制备率,3.,细菌原生质体再生,4.,原生质体融合,6.,重组体分析和鉴定,第九节 放线菌原生质体融合育种,一、放线菌细胞壁组成、结构及水解,(,一,),细胞壁组成和结构：类似于,G,菌,(,二,),细胞壁水解,1.,水解酶,2.,酶解环境条件,二、放线菌原生质体融合育种技术,(,一,),培养基与溶液,(,二,),菌体培养及预处理,(,三,),原生质体制备,(,四,),原生质体再生,(,五,),原生质体融合与再生,(,六,),融合体的检出,第十节 酵母菌原生质体融合育种,一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记,单细胞真核微生物,二、酵母菌原生质体融合育种技术,(,一,),出发亲本菌株的筛选及单倍体分离,(,二,),酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液,(,三,),原生质体制备：蜗牛酶,(,四,),原生质体再生,(,五,),酵母菌原生质体融合,(,六,),融合重组体鉴定与遗传分析,第十一节 霉菌原生质体融合育种,霉菌原生质体融合育种程序,二、培养基及溶液,三、霉菌原生质体融合分关键步骤,(,一,),霉菌原生质体制备：多种水解酶,(,二,),原生质体再生,(,三,),原生质体融合和再生,(,四,),融合重组体分析与鉴定,