微生物与基因工程9.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程(,genetic engineering),或重组,DNA,技术(,combinant DNA technology),是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。,克隆(,clone):,无性繁殖系的意思。,一、基因工程的发展历史,第一节 基因工程概述,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验,1944,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,美国斯坦福大学的科学家构建,第一个,重组,DNA,分子,1977 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上,第一家,遗传,工程公司,专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物,1980 开始建造,第一家,应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂,1997 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,二,、,基因工程的基本过程,1.分离或合成基因；,2,.通过体外重组将基因插入载体；,3.,将重组,DNA,导入细胞；,4.,扩增克隆的基因；,5.,筛选重组体克隆；,6.,对克隆的基因进行鉴定或测序；,7.,控制外源基因的表达；,8.,得到基因产物或转基因动物、转基因植物,。,2,、重组,3,、转化,4,、筛选,5,、克隆,6,、表达,表达产物分离纯化,三、微生物学与基因工程的关系,2.,克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；,3.,工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化的；,4.,微生物细胞是基因克隆的宿主；,5.,大多数基因产品都是通过微生物发酵生产；,1.,微生物的多样性为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；,6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生物的研究。,第二节 基因的分离、合成和定位诱变,一,.,从基因文库或,cDNA,文库中分离目的基因,1.,从基因文库中分离目的基因,1,）基因文库的构建,基因文库就是指基因组,DNA,片段的全部克隆。即将整个基因组用合适的限制性酶切成合适长度的片段，并用一种载体将全部片段进行克隆，文库中每一个克隆只含基因组某一特定的,DNA,片段。,制备基因组,DNA,文库,分离、纯化基因组,DNA,条件：,温和，在,EDTA,或,SDS,等存在下,限制酶部分消化,用蛋白酶,K,消化细胞、酚抽提,大小不同,DNA,酶切片段,片段分离：,常用蔗糖梯度或电泳分离,分别与同样,RE,消化的载体连接,常用噬菌体载体或质粒载体,DNA,连接酶连接。,导入细胞,进入宿主细胞内培养扩增。,筛选鉴定,用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。,理想的基因组文库应包含该生物基因组全部遗传信息。,通常基因组越大需要的克隆数越多，要求库容量也越大。,基因组文库的大小的估算：,N=ln,（,1,P,）,/ln,（,1,f,）,N,：为基因组文库必需的克隆数目。,P,：为文库中含目的基因,DNA,片段的出现概率。,f,：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。,DNA,文 库,2.,从,DNA,文库中分离目的基因,cDNA,文库是指生物,mRNA,的全部,cDNA,克隆。文库中每个克隆只含一种,mRNA,信息,制备,cDNA,文库,（,1,）合成,cDNA,第一条链,反应体系含有,mRNA,、逆转录酶、,4,种,dNTP,、引物。,引物是与,mRNA3,端,polyA,互补的寡聚,dT,（,12,18dT,片段）,（,2,）合成,cDNA,第二条链,RNase,去掉模板,mRNA,（,3,）构建,cDNA,文库,cDNA,两端加接头或衔接头,接头,是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。,衔接头,是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。,cDNA,与载体相连。,导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存,cDNA,集合体便是,cDNA,文库。,分离目的基因,的,mRNA,逆转录生成,cDNA,单链,水解去除,mRNA,，,合成,cDNA,双链,水解回折处单链,得到平端双链,cDNA,导入宿主细胞克隆,构建,cDNA,文库,从基因文库中筛选目的基因,根据目的基因序列，利用标记的基因探针、限制性内切酶、,PCR,或其他方法从文库中筛选出目的基因。,为了大量筛选目的克隆，常将克隆菌落或噬菌斑转印到滤膜上，再用基因探针与之杂交。,用,DNA,测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用,DNA,合成仪通过化学合成原理合成目的基因。,一般先合成短片断,DNA,，然后再拼接成长片段。,二、基因的化学合成,有两种方法：,逆转录法：以信使,RNA,为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成,DNA(,基因,),。,直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使,RNA,核苷酸顺序，再据此推算出基因,DNA,的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,DNA,合成仪,三,PCR,扩增基因,PCR,扩增仪,1984，穆利斯（,Mullis）,发明了,聚合酶链式反应(,polymerase chain reaction，PCR),在体外快速扩增特定,DNA,序列的新技术,。,1.PCR,扩增原理,引物与模板,DNA,相结合并沿模板,DNA,延伸，以扩增靶,DNA,序列。,如果,DNA,片段两端的序列,是已知的，采用,PCR,就可将此,DNA,片段扩增出来。,PCR,过程需要合成,两个寡聚核苷酸,作引物，并各自与所要扩增的靶,DNA,片段的末端互补。,(1)变性(,denaturation),加热，模板,DNA,经热变性，双链被解开，成为两条单链。9296,(2)退火(,annealing),温度下降，寡核苷酸引物与模板,DNA,中所要扩增序列两端的碱基配对。4060,(3)延伸(,extension),在适宜条件下，引物3端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的,DNA,链。6572,DNA,片断呈2的指数增长，12,h,重复2030次循环，,DNA,扩增至10,6,10,7,。,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,-,变性,PCR,循环,退,火,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,PCR,循环,延伸,PCR,整个过程,2.,来自微生物的耐高温,DNA,聚合酶,Taq,DNA,聚合酶,：,1988，从,水生栖热菌,(,Thermus aquaticus,),中分离，,在,95,温度下保持,稳定,，在高温下以单链,DNA,为模板合成互补链，一次加酶可满足,PCR,全过程需求。缺乏校正功能。,Pfu,DNA,聚合酶和,Vent DNA,聚合酶,：,是一类既耐热又具校正功能的酶，提供了,PCR,产物的特异性。,Pfu,是从火球菌（,Pyrococcus Furiosus,）,中分离的。,VentDNA,聚合酶从极端耐热菌中分离的。,Tth,DNA,聚合酶：,同时具有逆转录酶活性。可使,RT-PCR,在同一体系中进行，先将,RNA,逆转录成,DNA,，作为,PCR,的模板，再进行,PCR,。从嗜热菌中分离,3.PCR,技术的应用,（1）可用于,DNA,的扩增和克隆：制备单链或双链,DNA,探针；基因拼接、定位诱变和,DNA,测序；转基因动、植物。,（2）在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。,（3）用于法医，以鉴别个体和判定亲缘关系。,（4）动、植物检疫。,四,.,基因的定位诱变,（,site-directed mutagenesis,）,使已克隆基因或,DNA,片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。,1)寡核苷酸指导的定位诱变,应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行,DNA,复制，使寡核苷酸引物成为新合成的,DNA,子链的一个部分。,P272,2)盒式诱变,(cassette mutagenesis),3,）,PCR,定点诱变,第三节 微生物与克隆载体,克隆载体的基本要求,：,能够进行独立自主地复制；,含有多克隆位点，即具有若干限制酶的单一切点，便于外源基因的插入；,具有可供选择的遗传标记。,克隆载体(,cloning vector)：,负责将外源基因送入寄主细胞并进行复制与,扩增的运载工具,。,具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外不自由扩散。,一、质粒载体,1.质粒克隆载体的特性,（1）具有独立复制起点；,（2）具有较小的相对分子质量；,（3）具有较高拷贝数；,（4）含有多克隆位点，具有便于选择的标记；,（5）易于导入细胞；,（6）具有安全性。,2.质粒,pBR322,的结构特点,（1）环状双链的,DNA,分子，由4361,bp,组成；,（2）可插入小于5,kb,左右的外源,DNA，,超过10,kb ，,复制时不稳定；,（3）是松弛型质粒，在细胞中有较高的拷贝数；,p：,质粒，大写字母：两个发现者名缩写，数字：编号,。,（4）具有四环素(,Tet,r,),和氨苄青霉素(,Amp,r,),两种抗性基因；,（5）有24种限制酶的单一切点，其中7种位于四环素抗性基因之内，3种位于氨卡青霉素抗性基因之内。,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,二、,噬菌体载体,（1）,噬菌体载体,优点,寄主大肠杆菌，多面体头部，直径64,nm，,尾部长150,nm；,线状双链,DNA,每条链5端是一个长12个核苷酸的单链（粘性末端，,cos,位点），两条单链互补在细胞内两端可环化（环状,DNA,含48502,bp）。,分子遗传学背景十分清楚；,容量较大，能容纳大约23,kb,的外源,DNA,片段；,具有较高的感染效率，几乎可达100%（质粒转化率只有0.1%）。,控制在使重组,DNA,为野生型,DNA,长度的78%105%之间，否则不能正常组装（头部容纳,DNA,的量是一定的）,。,（2）构建,插入外源,DNA,的长度要有一定限度。,删除基因组中非必须区，使基因组变小，有利于克隆大,DNA,片段；,除去多余的限制位点；,重组,DNA,与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒。,三、柯斯质粒载体(,cosmid vector),即黏粒载体,，由,噬菌体的粘性末端和质粒构建而成的质粒。,cosmid,一词的意思是带有,cos,位点的质粒,。,1.柯斯质粒(,Cos),载体的构建,（1）,噬菌体的粘性末端：,cos,位点是,噬菌体包装,DNA,所必须的。,（2）质粒：一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点。,具有克隆大片段外源,DNA,的能力。,柯斯质粒本身一般只有57,kb,左右，而它克隆外源,DNA,片段的极限值可高达45,kb。,2.优点：,具有噬菌体的高效感染力，在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体，仅以质粒形式存在；,重组,DNA,注入宿主细胞后，线性化的具有粘性末端的,DNA,首尾相接形成环状分子，同质粒一样进行复制；,四、,M13,噬菌体载体,突出优点是用于制备克隆基因的单链,DNA。,1.M13,是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状,ssDNA，,大小为6407,bp,，感染雄性大肠杆菌（,F+,或,Hfr,）后成为复制型,dsDNA,，滚环复制产生,ssDNA,；,2.M13,载体克隆外源,DNA,的能力较小，一般只适于克隆30040,0bp,的外源,DNA,片段；,五、噬菌粒载体,噬菌粒(,phagemid),是由丝状噬菌体和质粒,DNA,融合而成,含有,M13,的复制起点和质粒的复制起点、选择标记和多克隆 位点。,优点：,载体本身分子小，约为3000,bp，,便于分离和操作；,可克隆,l0kb,外源,DNA,片段；,可用于制备单链或双链,DNA，,克隆和表达外源基因,。,六、真生核物的克隆载体,1.酵母质粒载体,能分别在细菌和酵母菌中复制属于,穿梭质粒,酵母质粒载体都是利用酵母的2,m,质粒和其染色体组分与细菌质粒,pBR3,22构建而成的。,含有来自细菌质粒,pBR322,的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（,AMP,r,）。,有来自酵母 2,m,质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的,URA3,基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因 3,.,这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。,附加体质粒（,epislmal plasmid）,复制起始点,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,尿嘧啶核苷酸合成酶基因3,酵母2,m,质粒的复制起点,来自酵母,细菌质粒,pBR3,22,含有来自细菌质粒,pBR322,的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（,AMP,r,）,和四环素抗性基因（,Tet,r,）。,有来自酵母染色体的自主复制序列（,ARS），,作为酵母重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。,复制质粒（,replicating plasmid）,复制起始点,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,尿嘧啶核苷酸合成酶基因3,酵母染色体,的复制起点,来自酵母,细菌质粒,pBR3,22,色氨酸合成酶基因1,含有来自大肠杆菌质粒,pBR322,的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（,AMP,r,）,和四环素抗性基因（,Tet,r,）;,来自酵母的,URA3,基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体,DNA,进行同源重组。,这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合至酵母染色体上，成为染色体,DNA,的一部分。,整合质粒（,integrating plasmid,）,复制起始点,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,尿嘧啶核苷酸合成酶基因,3,来自酵母,细菌质粒,pBR3,22,2.Ti,质粒载体,冠缨病的病原菌根瘤土壤杆菌中，决定冠缨病的质粒叫,Ti,质粒，即,tumor-inducing plasmid,。,Ti,质粒上有一段,T-DNATi,质粒基因组中被转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定,DNA,片段。,植物基因工程载体,七、人工染色体,1.,酵母人工染色体,3.,真核生物病毒载体,哺乳动物病毒载体（,SV40、,腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒）；昆虫病毒载体；植物病毒载体。,经改造后可作为基因载体。,酵母人工染色体（,yeast artificial chromosome,YAC）,是一类目前能容纳最大外源,DNA,片段人工构建的载体。酵母染色体的控制系统主要包括三部分：,着丝粒（,centromere,CEN）,，,它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞；,端粒（,telomere,TEL），,位于染色体两个末端，功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体,DNA,复制过程中两端序列的丢失；,酵母自主复制序列（,autonomously replicating sequence,ARS）,其功能与酵母细胞复制有关。,YAC,克隆外源,DNA,能力非常大，一个,YAC,可插入长达,10,6,碱基以上,DNA,片段。因此,YAC,既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前,YAC,已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。,优点：能携带大片段,DNA,，约,300kb,。,在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产,DNA,。,2.,细菌人工染色体（,BAC）,缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆,DNA,部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，,E coli,中的,F,因子。此质粒含有,2,种基因（,part A,part B,）。每个,E coli,能接受,300kbDNA,片段。,一、限制性核酸内切酶,(,restriction endonuclease),第四节 微生物与基因工程工具酶,简称,限制性酶,(,restriction enzyme),是指能识别双链,DNA,分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割,DNA,的一类内切酶。,在细菌细胞内限制性酶与,DNA,甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。,限制酶分为,、,、,III,三种类型,，通常所说的限制性核酸内切酶，即指,型,限制酶。,1.命名,Eco,RI,E,：,大肠杆菌属名第一个字母；,co,：,种名头两个字母；,R：,株名；,I：,该菌中第一个被分离出来的酶。,副溶血嗜血杆菌的酶表示为,Hph,I,(,H,aemophilus,p,ara,h,aemolyticus,),副流感嗜血杆菌的酶表示为,Hpa,I,(,H,aemophilus,pa,rainfluenzae,),属名相同，种名头四个字母相同，第三个字母用种名后的另一个字母代替。,2.限制性核酸内切酶的基本特性,识别序列通常由,48个碱基对,组成，,具有二重旋转对称轴，呈回文结构,。,所有限制酶切割,DNA,后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端。,(1)形成粘性末端,（2）形成平末端,产生,5-,粘性末端,产生,3-,粘性末端,平端切口,粘端切口,基因组不同长度的酶切片段可用凝胶电泳区分开,二、,DNA,连接酶,催化两个双链,DNA,片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键。,T4DNA,连接酶,：,通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。,大肠杆菌,DNA,连接酶：,不能催化,DNA,分子的平端连接。,DNA,聚合酶,I,：,由5向3逐一增加核苷酸，填补双链上的单链缺口。,一、外源基因与载体的体外连接,第五节 外源基因导入寄主细胞,（主要有以下,4,种连接方式）,1),黏性末端连接,2,）人工接头法,3,）均聚物加尾法,4,）平头末端连接,1,粘性末端连接,将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过,DNA,连接酶作用将两者连接起来，构成重组,DNA,分子。,2,人工接头法,合成连接子,与,DNA,平头末端连接,限制酶切割,产生粘性末端,连接，构建重组,DNA,。,3,同源多聚尾连接法,4,平头末端连接,某些限制酶只能将目的基因和载体,DNA,切割成平端，此时在,T,4,DNA,连接酶的作用下同样能连接起来。,所,用,ATP,及,T4DNA,连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些（大于,2.5,倍）,二、克隆载体对宿主的基本要求,能够高效吸收外源,DNA；,具有使外源,DNA,进行高效复制的酶系统；,不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源,DNA,发生降解；,一般为重组缺陷型(,RecA,-,),菌株，使克隆载体,DNA,与宿主染色体,DNA,之间不发生同源重组；,便于进行基因操作和筛选；,具有安全性:宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。,1.原核生物宿主,大肠杆菌,和枯草芽孢杆菌,转染和电穿孔法。,质粒克隆载体,选择易于形成感受态细胞的细菌作为宿主，有利于对外源,DNA,的吸收。,经体外包装的,噬菌体克隆载体或柯斯质粒载体,并以感染方式进入细胞,选择,的敏感宿主,作为克,隆载体,宿主。,（2）大肠杆菌作为宿主的优缺点,优点,：,生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等。,缺点：,条件致病菌和产生内毒素。,一些诱变的大肠杆菌已解决了以上大部分问题。,2.真核生物宿主,酿酒酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞,。,外源,DNA,导入宿主细胞的方式,：,酿酒酵母以转化方式。,哺乳动物细胞微量注射法和电穿孔法。,1、外源基因导入原核细胞,（一）、外源基因导入原核细胞,转化：在原核生物中，通过将外源,DNA,导入受体细胞，从而获得新的遗传物质的方法。如氯化钙法。,三 外源基因导入寄主细胞,转染,:,Transfection,Transfection,of eukaryotic cells is the acquisition of new genetic markers by incorporation of added DNA.,“,对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词”,转导,:Transduction,Transfer of host DNA from one cell to another by a virus,以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的,DNA,片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导,generalized transduction,：,通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何,DNA,小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象,restricted transduction,（,Specialized transduction,）：,通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象,1.,酵母,(1),原生质体法,(2),离子溶液法,(3),一步法,(4),电穿孔法,(5)PEG1000,法,(,二,),、外源,DNA,导入真核细胞：,动物细胞：,磷酸钙共沉淀法：将氯化钙、,DNA,和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙,-DNA,共沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用纳入细胞。该方法的转化效率通常很低,DEAE-,葡聚糖法：,DEAE-,葡聚糖是一种高分子的多聚阳离子试剂，能结合,DNA,并促使细胞吸收,电穿孔法：指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，促使细胞吸收外源,DNA,分子。脉冲的最大电压和脉冲持续时间，是影响电穿孔转染效率的两个主要因素,脂质体法：,脂质体是一种人造的封闭磷脂膜，强极性的,DNA,分子可被包裹在脂质体内部的水相。,脂质转染法：,将外源,DNA,和阳离子型的脂质体混合形成,DNA-,脂质复合物（,DNA-lipid complex,），这种复合物可被受体细胞捕获，实现基因的高频率转移。这个过程中，,DNA,并不是被包裹在脂质体内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起。,脂质体载体法：类脂经机械搅拌、超声波等处理，形成双脂层小囊泡，将外源,DNA,包装在脂质体的内部，在融合剂如,PEG,或植物凝集素的作用下，靶细胞和装载,DNA,的脂质体融合，通过胞吞作用将脂质体摄入胞内。,动物病毒法：包括逆转录病毒载体和腺病毒载体等,显微注射法：在显微镜下，将,DNA,用玻璃显微注射器直接注射入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧,植物：,制备原生质体，氯化钙、聚乙二醇（,PEG,）、磷酸钙处理；电穿孔法和脂质体法，显微注射法；植物病毒法,农杆菌法：,Ti,质粒，即,tumor-inducing plasmid,基因枪法,：使用高能微粒子轰击将,DNA,导入细胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附,DNA,，将这些微弹加速到很高的速度轰击细胞,基因枪,四、目的克隆的筛选和鉴定,1.载体选择标记的鉴定,筛选含有目的基因的重组体并鉴定其正确性，通常有三种鉴定方法：,1）抗生素平板法,因为自身环化的载体和为被酶解的载体在抗生素平板上也能生长，所以假阳性率较高。,大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（,ampicillin,Amp）、,四环素(,tetracycline,Tet)、,卡那霉素(,kanamycin,Kan),抗性基因。外源基因插入位点在抗性基因之外，带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌，宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。,抗,Amp,宿主细菌,含,Amp,培养基,外,源,DNA,插入载体的位点位于抗生素抗性基因之内，转化后的重组体在含该抗生素的平板上不能够生长。,2）插入失活法,3,）,-半乳糖苷酶显色反应法,-,互补,(,蓝白筛选,),某些载体，如,M13,噬菌体、,pUC,和,pGEM,等质粒，携带,lacZ,基因的一段序列，编码,-半乳糖苷酶的,肽，而寄主细胞为,lacZ,基因突变体。含质粒的菌体在含有,X-gal,和,IPTG,平板上生长时，由于基因互补，产生有活性的,-半乳糖苷酶，将培养基中的,X-gal,分解成半乳糖和蓝色的5-溴-4氯靛蓝使菌落呈蓝色。,互补的检测,多克隆位点在,lac Z,基因内部，外源,DNA,插入使,lac Z,基因失活，产生白色菌落,（,LacZ,基因,N,端序列）,插入片段,（,LacZ,基因失活）,宿主不含,LacZ,基因,N,端序列,LacZ,酶,（,2,）,蓝,-,白,筛选,它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码,-,半乳糖苷酶的基因。,载体：,编码,-,半乳糖,宿主：,编码,-,半乳糖,苷酶,N,端,序列,苷酶,C,端,序列,-,互补,细菌表达：,-,半乳糖苷酶活性蛋白,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚（,X-gal,）,形成,蓝色菌落,当在质粒中插入外源,DNA-,半乳糖苷酶的,N,端基因失活,不能与宿主,-,半乳糖苷酶的,C,端,进行,-,互补,产生,白色菌落,。,（,IPTG,存在下）,蓝,白,筛选,示意图,2.目的基因序列的鉴定,1）菌落（活噬菌斑）原位杂交（,in situ hybridization),转化细胞形成菌落或噬菌斑 将硝酸纤维素膜贴在平板上使菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上(取两张膜)，一张置另一平板上长出菌落或用噬菌斑裂解液处理使菌体裂解释放,DNA,碱处理使,DNA,变性并经烘烤失其固定在膜上 用经标记过的探针进行分子杂交筛选阳性克隆(另一张膜置于新鲜培养基上培养，以便从中挑取阳性菌落)。,此方法可在短时间内从成千上万的克隆中快速筛选到阳性克隆.,原位杂交,Southern,印迹,2)内切酶图谱鉴定,培养筛选的阳性克隆 提取质粒或重组噬菌体 1-2种内切酶酶切 凝胶电泳检测插入片段的大小。,3),PCR,鉴定,以插入片段两侧设计引物,以重组质粒为模板进行,PCR,扩增。,4),DNA,序列鉴定,为确定目的序列的正确性必须对重组体,DNA,进行测序分析。,2.,限制性内切酶图谱鉴,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的,PCR,扩增片段,3.外源基因表达产物的鉴定,1)表达产物的免疫活性的测定,表达产物若为蛋白质,可根据抗原抗体反应鉴定。操作类似原位杂交，将蛋白质固定到膜上后，与标记抗体反应，采用放射自显影或酶联反应鉴定。,2)表达产物的生物活性检查,3)表达产物的氨基酸序列测定,根据表达产物的生物活性鉴定。,测定表达产物的,N,末端序列对于表达产物的鉴定有特别重要的意义,免疫化学检测法,滤膜（固定抗体）,+,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,第六节 外源基因在细菌中的表达,基因工程的目的是使外源基因能在细菌、酵母活动植物细胞中得到高效表达，以便得到大量有益的基因产物或改变动植物的遗传性状。,克隆载体主要能携带外源基因并具有复制起始序列，保证外源基因在宿主细胞中有效扩增,表达载体除了能携带外源基因外，还必须含有宿主细胞基因表达所需的调控序列，保证外源基因在宿主细胞中高效转录和翻译，产生大量基因产物。,表达载体的要求,完整的表达载体（质粒）应有,1）强启动子（,P）,2）,核糖体结合位点,3）终止子（,T）,4）多个酶切位点、有抗性标记、复制子和密码子的偏爱性等。,还应结合考虑：,质粒的拷贝能力和稳定性，转译蛋白的表达形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质的分子量、性质和稳定性以及选择合适宿主细胞。,真核基因在原核细胞中表达的特点,真核生物的启动子不被原核生物的,RNA,聚合酶识别。,真核生物的,mRNA,上没有,SD,序列，不能被原核生物的核糖体结合起始翻译。,真核生物的基因含有内含子原核细胞缺乏转录后,RNA,剪接加工功能。,真核生物的基因产物存在翻译后加工过程，原核生物缺乏相关酶。,易被原核细胞的蛋白酶降解。,真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，,RNA,剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆,菌为宿主。,真核多肽的表达要求：,1,）适当的,cDNA,（完整的编码序列）；,2,）适当的表达载体，提供特定多肽信息；,3,）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。,产物特征：,1,）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；,2,）活性受限或无活性。,E.coli,表达体系,优势：,一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行遗传操作和高效,表达,不足之处：,1,）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。,2,）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。,3,）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。,一、外源基因的转录,1,、启动子,为使外源基因在寄主细胞中获得高效表达，必须首先使其高水平转录，因此选择合适的强启动子是重要的环节。,2,、转录的调节和控制,某些蛋白质可能对宿主细胞有毒，外源蛋白的过量表达会影响寄主细胞的生长。因此须对外源基因的转录进行控制。,如果控制在宿主细胞生长早期，外源基因不转录，而当寄主细胞数量达到足够量后，再打开外源基因的转录开关，使外源基因高效表达，产生大量基因产物。,常用的转录调控方式,1,）诱导物诱导,无诱导物时，寄主细胞大量生长，加入诱导物，打开转录开关，启动外源基因转录。,2,）温度诱导,当用温度敏感突变株表达外源基因是，,30,度细胞大量生长；当温度升高至,42,度是，转录开关打开，启动外源基因转录,3,）,RNA,聚合酶调节,利用噬菌体,T7,启动子和,RNA,聚合酶作为调节系统。,3、转录终止子,终止转录，保证mRNA的稳定性。,二、外源基因的翻译,1,、核糖体结合位点,原核生物遗传信息的翻译起始于,mRNA,上的核糖体结合位点，特别是位于其中的,SD,序列，由于真核生物,mRNA,上没有,SD,序列，所以用原核细胞表达真核基因时，真核基因必须置于原核细胞,SD,序列之后。,2、密码子的偏爱性,3、终止密码子,三、外源基因的表达产物,外源基因在原核细胞中的表达主要有以下几种形式：,1,、非融合蛋白的表达,指外源蛋白不与宿主蛋白融合，自身单独表达。,非融合蛋白表达载体是将带有起始密码子,ATG,的真核基因插入到合适的原核细胞启动子和,SD,序列下游。经转录和翻译，在原核细胞中表达非融合蛋白。,非融合蛋白表达优点是可直接产生天然的外源蛋白，便于产品的后加工处理。,缺点：,易被细菌细胞内的蛋白酶降解。可采用胞内蛋白酶含量低的大肠杆菌突变株作为表达宿主，或利用胞内蛋白酶抑制剂，或将外源蛋白分泌到胞外等方法防治外源蛋白被降解。,2、融合蛋白表达,融合蛋白表达使之表达产物是外源蛋白于宿主蛋白结合而形成的杂合蛋白。,融合蛋白表达载体：将原核细胞操纵子的起始部分（包括启动子、操纵基因、核糖体结合部位和原核基因的N 端序列）与外源基因的编码序列连接，并使其阅读框架保持一致，以保证所翻译的外源蛋白的正确性。,融合蛋白,融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。表达的蛋白质或多肽的,N,末端由原核,DNA,编码，,C,末断由克隆的真核,DNA,编码。,融合型表达载体的,SD,序列后面带有一段大肠杆菌蛋白质的结构基因，此结构基因的3端为多克隆位点，便于目的基因插入，经转录和翻译之后，即产生融合蛋白。,（,3,）融合型异源蛋白的表达,融合型异源蛋白表达的特点,稳定性大大增加。,分离纯化程序简单。,表达效率较高。,异源蛋白从融合蛋白中的回收,化学法,酶解法,表达融合蛋白的优点,(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。,(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。,(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。,(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。,(5),目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在,胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。,外源基因表达产物在细菌内的存在形式有可溶性和不可溶性两种方式。表达产物在宿主中的存在形式是可变的。培养基的营养状况好，诱导表达的时间短，降低表达效率都有利于可溶性表达产物的形成。反之则容易形成不可溶性的表达产物即包涵体。,包涵体及其性质,(2),包涵体型异源蛋白的表达,3、外源蛋白的分泌表达,如果合成的外源蛋白能不断从细胞中分泌出来，不仅能免受宿主细胞内蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。,分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需将信号肽的编码序列和外源基因连接，以便使信号肽和外源蛋白融合，信号肽携带外源蛋白越膜分泌到胞外。,4、包涵体,当外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达时，在细胞质内常常积聚了大量难溶的、非正确折叠的、无生物活性的外源蛋白，称为包涵体。,以包涵体形式表达重组异源蛋白的优点,：,外源基因表达的蛋白质分离易达到高纯度和高浓度。,异源重组在大肠杆菌细胞内的稳定性主要取决于形成包涵体的速度。,以包涵体形式存在的外源基因表达产物没有活性，对于那些有毒性的表达蛋白来说，以包涵体形式存在则使宿主细胞免受伤害。,包涵体表达形式的缺点：,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过,30%。,包涵体的溶解与变性,包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键,。,包涵体的复性与重折叠（,refolding）,包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠，通过次级键的形成使蛋白质复性,我国生产的部分基因工程疫苗和药物,1,基因工程药物,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,第七节基因工程的应用与展望,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，,100Kg,胰腺只能提取,4-5g,的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每,2000L,培养液就能产生,100g,胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了,30%-50%!,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，,300L,血才提取,1mg,！其“珍贵”程度自不用多说,。,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,2,基因诊断与基因治疗,运用基因工程设计制造的“,DNA,探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。,我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞,通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。,基因诊断,基因诊断是用放射性同位素(如,32,P)、,荧光分子等标记的,DNA,分子做探针，利用,DNA,分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。,生物芯片,从正常人的基因组中分离出,DNA,与,DNA,芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出,DNA,与,DNA,芯片杂交就可以得出病变图谱。,通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的,DNA,信息。,基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,基因治疗,基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,取患者骨髓,分离干细胞,病毒,正常基因,并入正常基因的干细胞,注入患者体内,3),基因工