分子生物学RNA复制与逆转录.pptx

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virus,，,HBV,）,不完整环状,dsDNA,，外环（,DNA,）完整而“内环”（,+DNA,）有缺口；,天花病毒（,variola virus,，,VARV,线性,dsDNA,，末端含有共价闭合发卡环结构，其由正负链两端单链部分本身配对而成；,花椰菜花叶病毒（,cauliflower mosaic virus,，,CaMV,不连续开环双链,DNA,，进入宿主细胞后可成超螺旋结构；,猴病毒,40,（,simian virus 40,，,SV40,）病毒,基因组是环状,dsDNA,。,5,5/31,7.1.1.2 RNA,病毒,RNA,病毒所含,RNA,分子大多为线性。,6,少数单链,RNA,病毒体内含有各种,RNA,，如甜菜坏死黄脉病毒（,Beet Necrotic Yellow Vein Virus,，,BNYVV,），基因组包含,5,种单链,RNA,。,6/31,+RNA,病毒与,mRNA,相同，可直接作为翻译模板用于合成蛋白质。,RNA,病毒则需要借助,RNA,复制酶作用，以本身,RNA,为模板合成与原病毒互补,+RNA,链，再以此,+RNA,链为模板翻译生成蛋白质。,RNA,病毒按基因合成方式又可分为：,RNA,复制型病毒,RNA,逆转录型病毒,7,7/31,植物病毒，除少数例外（如花椰菜花叶病毒），几乎都是,RNA,病毒。,其中，单链,RNA,病毒占,RNA,病毒,75%,，大约有,4700,种。,另外，感染动物,HIV,（,human immunodeficiency virus,，人类免疫缺点病毒）、,SARS,（,severe acute respiratory syndrome,，非经典性肺炎）病毒、甲型,H1N1,（,hemagglutinin 1 and neuraminidase 1,）流感病毒、禽流感病毒等均属于,RNA,病毒。,8,8/31,7.1.2,经典病毒介绍,7.1.2.1,烟草花叶病毒,图,7-2,烟草花叶病毒电镜照片,1935,年,，,美国科学家,W,.,M.Stanley,首次从,烟草,病叶榨汁中分离取得,，为,RNA,病毒。,9,9/31,图,7-3 HIV,基因组结构,7.1.2.2,人类免疫缺点病毒（,HIV,）,1983,年首次被报道，是一个感染人类免疫系统细胞,逆转录病毒,，基因组为两条相同,+RNA,，,5,端由氢键连接，每条,RNA,长约,9.2-9.8kb,。,10,10/31,病毒只有在侵入细胞后才表现出生命现象，复制必须在细胞内进行。不过,RNA,病毒复制和转录过程往往完全独立于宿主细胞核，许多,RNA,病毒在细胞质中复制。只有少数,RNA,病毒繁殖过程中进入宿主细胞核，如禽流感病毒（,avian influenza virus,，,AIV,）。,7.2,病毒,RNA,复制,11,11/31,7.2.1 RNA,复制酶类,由病毒自己编码,RNA,复制酶,主要是依赖,RNA,RNA,聚合酶（,RNA-dependent RNA polymerase,，,RdRP,）。,RNA,复制酶功效与特征：,以“,RNA”,为模板合成“,+RNA”,活性高，而以“,+RNA”,为模板合成“,RNA”,活性低；,合成,RNA,链方向为,53,；,能将互补双链,RNA,分开；,缺乏核酸酶活性，校正功效低，差错率高；,多数分布在细胞质中，少数在细胞核中；,酶活性含有可调控性，复制时，,RdRP,抑制外壳蛋白表示，而成熟期，外壳蛋白抑制,RdRP,活性。,12,12/31,图,7-4 +RNA,病毒复制,7.2.2 +RNA,病毒复制和侵染,小,RNA,病毒科和披膜病毒科病毒基因组都是,+RNA,，比如,SARS,病毒。,13,13/31,7.2.3 RNA,病毒复制和侵染,这类病毒包含滤泡性口腔炎病毒、流感病毒、副流感病毒、莴苣坏死黄化病毒、麻疹病毒、狂犬病毒等。,图,7-5 RNA,病毒复制,14,14/31,图,7-6,双链,RNA,病毒复制,7.2.4,双链,RNA,病毒复制和侵染,15,15/31,以,RNA,分子为模板合成互补,DNA,（,complementary DNA,，,cDNA,）分子过程，称为,逆转录,（,reverse transcription,）。,逆转录遗传信息流向,RNADNA,。,逆转录病毒，一类特殊,RNA,病毒，基因组为两条相同线性,+RNA,分子（,+dsRNA,），在靠近,5,端区域以氢键结合在一起。该,+RNA,分子无,mRNA,活性，必须在本身逆转录酶作用下逆转录生成双链,cDNA,，再与宿主细胞基因组整合，在宿主,RNA,聚合酶作用下转录出,mRNA,，才可作为模板进行翻译。,逆转录现象是分子生物学研究重大发觉，丰富和发展了中心法则。,7.3,逆转录,16,16/31,7.3.1,前病毒假说,1960,年，,H.Temin,提出前病毒假说（,provirus theory,），认为致病,RNA,病毒复制需经过,DNA,中间体（前病毒），此,DNA,中间体可部分或全部整合（,integration,）到寄主细胞,DNA,中，并随细胞增殖而传递至子代细胞。,前病毒假说认为遗传信息可由,RNA,传递给,DNA,，这种逆向转录遗传信息传递方式在当初是不能被生物学界所接收，因为按照传统“中心法则”，遗传信息只能从,DNA,传递给,RNA,，然后再到蛋白质，是一个单向传递过程。前病毒假说是对传统中心法则挑战。,17,17/31,7.3.2,逆转录性质与过程,逆转录是,RNA,水平基因合成,DNA,过程。,图,7-7,逆转录病毒与宿主基因组整合,18,18/31,7.3.2,逆转录性质与过程,逆转录病毒需借助于病毒颗粒表面蛋白和跨膜蛋白与宿主细胞相融合，病毒颗粒所携带基因组,RNA,以及逆转录和整合所需要引物（,tRNA,）和酶（逆转录酶和整合酶）得以进入宿主细胞内。在细胞质内进行逆转录，生成,cDNA,进入细胞核，在整合酶帮助下病毒,cDNA,整合到宿主染色体,DNA,内，成为前病毒（,provirus,）（图,7-7,）。前病毒可随宿主染色体,DNA,一起复制和转录。只有整合前病毒,DNA,转录,mRNA,才能翻译产生病毒蛋白质。所以，转录和整合所需酶必须由病毒颗粒本身携带。,逆转录过程：,19,19/31,图,7-8,逆转录病毒,RNA,复制过程,逆转录过程可分为十步反应，其中逆转录酶两次转换模板（或称两次跳跃）,20,20/31,7.3.3,逆转录酶,1970,年，,H.Temin,和,D.Baltimore,分别从致癌,RNA,病毒劳氏肉瘤病毒（,Rous sarcoma virus,，,RSV,）和鼠白血病病毒（,murine leukemia virus,，,MLV,）中发觉了能以,RNA,为模板合成双链,DNA,酶，即逆转录酶（,reverse transcriptase,），有力证实了前病毒学说。,21,21/31,逆转录酶,，全称为依赖,RNA,DNA,聚合酶（,RNA dependent DNA polymerase,），是一个含,Zn,2+,多功效酶。,该酶性质以下：,RNA,指导,DNA,聚合酶活性，即以,RNA,为模板合成互补,DNA,单链，形成,RNA-DNA,杂合分子；,RNase,活性，即水解,RNA-DNA,杂合分子中,RNA,链；,DNA,指导,DNA,聚合酶活性，即以,DNA,单链为模板，合成另一条,DNA,单链，形成双链,DNA,分子；,催化合成反应要求有模板、上下游引物、底物（,4,种,dNTP,），适当浓度二价阳离子（,Mg,2+,或,Mn,2+,）；,DNA,链延长方向按照,53,规律。,22,22/31,7.3.4,致癌病毒,RNA,繁殖过程,致癌病毒属于逆转录病毒，侵入宿主后细胞后并不引发细胞死亡，但可使细胞发生恶性转化，引发人和动物肿瘤，这类病毒包含人类免疫缺点病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。,23,23/31,图,7-9,致癌病毒,RNA,繁殖过程,24,24/31,7.3.5,乙肝病毒,DNA,侵染过程,乙型肝炎病毒（,HBV,）是一个,DNA,病毒，同时也是一个逆转录病毒，由外壳和关键颗粒两部分组成，外壳上蛋白也就是乙肝表面抗原（,HbsAg,）。基因组,DNA,位于关键颗粒内，为双链环状但局部区域是单链或有缺口,DNA,，,DNA,聚合酶依附其上。外环是长链为,DNA,，长度恒定，“内环”是圆弧短链,+DNA,，长度可变，约为长链,5080%,。,HBV,复制经由,DNARNADNA,逆转录过程，即病毒颗粒中,DNA,进入细胞之后，由病毒,DNA,转录出足够长度,+RNA,称为前基因组（,Pre-genome,），然后由,RNA,中介逆转录合成,DNA,，前基因组,RNA,降解，再以,DNA,为模板合成,+DNA,。对于这一,RNA,中介过程，,Summer,和,Mason,称其为前基因组假说。,25,25/31,图,7-10,乙肝病毒,DNA,复制及侵染过程,26,26/31,逆转录现象发觉与一个,RNA,病毒,劳斯肉瘤病毒（,RSV,）密不可分，该病毒由美国病理学家劳斯（,Rous,）首次分离。,1910,年，劳斯在研究一个鸡肉瘤时发觉，用鸡肉瘤组织研磨后无细胞滤液注射健康小鸡，接收注射小鸡也会发生相同肿瘤，继续使用新形成肉瘤重复试验得到相同结果，由此说明肿瘤组织滤液确实能造成肿瘤发生。因为已知能够经过滤孔唯一生命形式就是病毒，所以，劳斯依据该试验认为病毒能够造成癌症发生。但遗憾是这个重大发觉并没有得到科学界普遍认可，直到,20,世纪,50,年代，劳斯发觉才重新得到科学界认可，,1966,年，已经,87,岁高龄劳斯取得了该年度诺贝尔生理学与医学奖。,科学小故事,逆转录发觉,27,27/31,在此之后，为了阐释,RNA,病毒致癌理论，特明（,H.Temin,）继续对,RSV,进行研究，提出了著名前病毒假说，指出这类病毒存在着“,RNADNA”,特殊路径，在科学界引发了轩然大波。而证实逆转录现象确实存在直接证据是多年后逆转录酶发觉。,1970,年,H.Temin,和,D.Baltimore,分别从,RSV,和鼠白血病病毒中提取到了这种,RNA,依赖,DNA,聚合酶。另外，还有杜尔贝科（,R.Dulbecco,）在肿瘤研究中也支持了,H.Temin,“前病毒假说”。他们三人所以于,1975,年分享了诺贝尔生理与医学奖。,28,28/31,小结,病毒遗传物质能够是,DNA,，也能够是,RNA,，,DNA,病毒种类较少，多数病毒都属于,RNA,病毒。,RNA,病毒基因组有单双链之分，单链,RNA,病毒又有正、负链之分，每种,RNA,病毒复制及侵染机制不一样。,29,29/31,+RNA,既能够直接作为,mRNA,模板进行翻译，也能够作为模板合成互补,RNA,，新合成,RNA,则作为模板再合成,+RNA,而进行复制。,RNA,病毒侵染细胞后，先以,RNA,为模板合成互补,+RNA,，,+RNA,既能够作为模板合成,RNA,而进行复制，也能够被加工成,mRNA,进行翻译。,双链,RNA,病毒进入宿主细胞后先转录生成,+RNA,，其既可作为,mRNA,，又可作为病毒基因组模板，,mRNA,翻译生成结构蛋白包裹,+RNA,，在其内部深入形成双链,RNA,基因组。,30,30/31,逆转录是,RNA,病毒复制一个特殊方式，遗传信息流向为,RNADNA,，与转录过程相反。,RNA,先在逆转录酶作用下逆转录生成双链,cDNA,，与宿主基因组整合，然后在宿主细胞,RNA,聚合酶作用下转录出,mRNA,，才能够作为模板进行翻译过程。逆转录现象发觉丰富和发展了中心法则。致癌病毒和乙肝病毒均属于逆转录病毒。,Thank you,31,31/31,