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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,非水溶剂中酶促反应,有机介质中酶促反应概述,有机介质中反应条件,有机介质对酶性质影响,有机介质中酶催化应用,1/92,长久观点认为:有机溶剂是酶变性剂、失活剂这一传统酶学思想影响下，酶在有机介质中催化作用研究以前几乎毫无进展。这一观点直到1984年，非水溶剂中酶催化研究才取得了突破性进展。1984年美国Klibanov,A.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点综述。,Klibanov等工作在仅含微量水有机介质(Microaqueous media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。基于研究工作，libanov等提出只要条件适当，酶能够在非生物体系疏水介质中催化天然或非天然疏水性底物和产物转化，酶不但能够在水与有机溶剂互溶体系，也能够在水与有机溶剂组成双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水有机溶剂中表现出催化活性。这一观点无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想挑战,有机介质中酶促反应概述,2/92,有机相酶反应优点,有利于疏水性底物反应。,可提升酶热稳定性。,能催化在水中不能进行反应。,可改变反应平衡移动方向。,可控制底物专一性。,可预防由水引发副反应。,可扩大反应pH值适应性。,酶易于实现固定化。,酶和产物易于回收。,可防止微生物污染。,3/92,有机相酶反应具备条件,确保必需水含量。,选择适当酶及酶形式。,选择适当溶剂及反应体系。,选择最正确pH值。,4/92,有机相酶反应研究进展,超临界流体中酶反应,仿水溶剂和印迹技术,5/92,超临界流体中酶反应,指温度和压力均在本身临界点以上高密度流体，含有和液体一样凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又靠近于气体，是通常液体近百倍。,6/92,超临界流体相关性质,超临界流体P-V-T性质,7/92,所谓超临界CO,2,是指纯净CO,2,被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1，临界压力7.28Mpa)时状态。该流体含有没有毒、无臭、不燃等优点。,提升溶剂选择性基本标准,操作温度和超临界流体临界温度靠近,超临界流体化学选择和待分离溶质化学性质靠近,超临界流体相关性质,8/92,超临界流体萃取应用实例,9/92,有机相酶反应研究进展,超临界流体中酶反应,仿水溶剂和印迹技术,10/92,仿水溶剂和印迹技术,仿水溶剂体系原理,分子印迹技术,11/92,仿水溶剂体系原理,可用二甲基甲酰胺（,DMF,），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替换系统中辅助溶剂水，从而影响酶活性和立体选择性。,极性添加剂对体系影响,对反应体系内水分配影响,与蛋白质直接作用,对产物分配影响,应用举例：经过适当地添加少许,DMF,（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物得率从,51%,提升到,91%,，且反应活性也有所提升。,12/92,分子印迹技术,当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH,2,）水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应速度比不含抑制剂水溶液中冻干出来酶高100倍，但这么处理酶在水溶液中其活性与未处理酶相同。,原理：,竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生改变，形成一个高活性构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中高度刚性而得到保持。,酶蛋白分子在有机相中含有对配体“记忆”功效。,13/92,非水溶剂中酶促反应,有机介质中酶促反应概述,有机介质中反应条件,有机介质对酶性质影响,有机介质中酶催化应用,14/92,有机介质中酶促反应条件,必需水,酶选择,溶剂及反应体系选择,pH选择和离子强度影响,15/92,1.,必需水,概念,紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需最少许水。,16/92,1.,必需水,影响酶反应体系中需水含量原因,不一样酶需水量不一样。,同一个酶在不一样有机溶剂中需水量不一样，溶剂疏水性越强，需水量越少,17/92,2.,酶选择,酶种类选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。除与酶相关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系相关。,酶形式选择,酶粉 比如：有些人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发觉催化活性随反应体系中酶量降低而显著增加。,化学修饰酶 比如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解稳定性均高于天然SOD。,固定化酶 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其反抗有机介质变性能力、反应速度、热稳定性等都可提升。,18/92,3.,溶剂及反应体系选择,水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等,水不溶性有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等,酶促反应有机介质体系,：,单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）,两相体系（水/水不溶性有机溶剂）,低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）,反胶束体系,19/92,反胶束体系概念,和,表面活性剂,反胶束体系概念 表面活性剂分散于连续有机相中自发形成纳米尺度一个聚集体。反胶束溶液是透明热力学稳定系统。,表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油极性基团和亲油憎水非极性基团两部分组成两性分子。在有机相酶反应中用得最多是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。,20/92,有机溶剂影响酶催化方式,有机溶剂能经过直接与酶相互作用引发抑制或失活,增大酶反应活化能来降低酶反应速度。,降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成氢键，使酶活性下降。,酶三级结构改变，间接改变酶活性中心结构影响失活。,有机溶剂与扩散底物或产物相互作用而影响酶活,有机溶剂直接与酶附近必需水相互作用,21/92,4.,pH选择和离子强度影响,pH选择：在有机溶剂环境中，不会发生质子化及脱质子化现象。酶在水相pH值可在有机相中保持，同一个酶不一样起源，对pH值敏感程度大不相同。,离子强度影响：随冻干时用缓冲溶液离子强度增大，酶活会增大。,22/92,非水溶剂中酶促反应,有机介质中酶促反应概述,有机介质中反应条件,有机介质对酶性质影响,有机介质中酶催化应用,23/92,有机介质对酶性质影响,稳定性,活性,专一性,反应平衡方向,24/92,1.,稳定性,热稳定性提升,和,储存稳定性提升,结论：在低水有机溶剂体系中，酶稳定性与含水量亲密相关；普通在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量增加而急剧下降。,25/92,2,.,活性,刚-柔并存,刚性：生物大分子结构准确性,柔性：生物大分子局部区域含有一定可运动性。,（1）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响,有机溶剂直接作用于酶。,有些酶活性会伴随一些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）到达最大值；若浓度再升高，则活性下降。,（2）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保留，但也有一些酶活性亦改变。,例 有些人对吸附在不一样载体上胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水活度下酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而改变，在一定水活度下，酶活性随载体不一样而改变。,26/92,2,.,活性,（,3,）在反向微团体系中，微团效应使一些酶活性增加,超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值活性称为超活性（Super-activity）。,认为：,超活性是由围绕在酶分子外面表面活性剂这一外壳之较大刚性所引发。,依据：,微团水化程度（W）（W=H2O/表面活性剂）最正确值和酶活性最大值呈正相关,W值最正确时，微团内径总是相当于被包裹酶分子直径,27/92,3,.,专一性,一些有机介质可能使一些酶专一性发生改变，这是酶活性中心构象刚性增强结果。,有些在水中不能实现反应路径，在有机介质中却成为主导反应。,28/92,酶活性丧失可能原因,29/92,4.,反应平衡方向,酶,合成产物,有机溶剂,使用浓度（%）,合成收率（%）,枯草杆菌蛋白酶,核糖核酸酶,甘油,90,50,无色杆菌蛋白酶,人胰岛素,DMF和乙醇,30,80,羧肽酶,牛胰核糖核酸酶,甘油,90,50,凝血酶,人生长激素,甘油,80,20,嗜热杆菌蛋白酶,天冬甜味素,乙酸乙酯,胰凝乳蛋白酶,脑啡肽,乙醇或DMF,30/92,非水溶剂中酶促反应,有机介质中酶促反应概述,有机介质中反应条件,有机介质对酶性质影响,有机介质中酶催化应用,31/92,有机介质中酶催化应用,酶,催化反应,应用,蛋白酶,肽合成,酰基化,合成多肽,糖类酰基化,羟基化酶,氧化,甾体转化,过氧化物酶,聚合,酚类、胺类化合物聚合,胆固醇氧化酶,氧化,胆固醇测定,醇脱氢酶,酯化,有机硅醇酯化,脂肪酶,肽合成,酯合成,转酯,聚合,酰基化,青霉素G前体肽合成,醇与有机酸合成酯类,各类酯类生产,二酯选择性聚合,甘醇酰基化,32/92,手性药品拆分,概念：手性化合物是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体两种异构体化合物。,手性药品两种对映体药效差异,一个有显著疗效，另一个有疗效弱或无效,一个有显著疗效，另一个有毒副作用,两种对映体药效相反,两种对映体含有各自不一样药效,两种消旋体作用含有互补性,33/92,手性药品拆分方法,分为：非生物法、生物法,非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）,生物拆分法原理,实质即两个对映体竞争酶同一个活性中心位置，二者反应速率不一样，产生选择性，从而使反应产物含有光学活性。,青霉素酰化酶及其催化作用：,利用其底物专一性及对映体选择性进行光学异构体合成与拆分。,34/92,2、手性高分子聚合物制备,(1)可生物降解聚酯合成,(2)糖脂合成,3、酚树脂合成 如,辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶均一介质体系中，能够催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。,4、导电有机聚合物合成 如,辣根过氧化物酶能够在与水混溶有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。,5、发光有机聚合物合成 如,辣根过氧化物酶能够在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，能够发出蓝光。,6、食品添加剂生产 如,利用芳香醛脱氢酶生成香兰素。,7、甾体转化 如可松转化为氢化可松酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成系统中，转化率高达100%和90%。,8、生物能源 如生物柴油。,35/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,36/92,C-O键形成,酯类：酯酶和脂肪酶可催化酯合成反应、转酯反应和酸酐水解反应。,环氧化合物,糖苷键水解和形成,加氧氧化反应,37/92,酯合成反应,38/92,转酯反应,39/92,酸酐水解,40/92,环氧化合反应,41/92,糖焦磷酸化，糖异构化,42/92,糖衍生物,43/92,醇解,44/92,加氧氧化反应,45/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,46/92,C-N键反应,，,肽合成,47/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,48/92,C-C键形成,羟醛反应,酮醛和羟醛转移反应,醛缩合反应,乙酰辅酶A参加C-C键组成反应,醛加成反应,49/92,（1）羟醛反应,50/92,51/92,（2）酮醛和羟醛转移反应,52/92,（3）醛缩合反应,53/92,（4）乙酰辅酶A参加C-C键组成反应,54/92,（5）醛加成反应,55/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,56/92,还原反应,57/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,58/92,氧化反应,（1）C-H,C=C 氧化,（2）醇氧化,（3）苯酚氧化,（4）羧酸氧化,（5）C-N氧化,59/92,（）C-H,C=C 氧化,60/92,（）醇氧化,61/92,（3）苯酚氧化,62/92,（）羧酸氧化,63/92,（5）C-N氧化,64/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,65/92,异构化反应,66/92,有机溶剂中酶促反应,C-O键形成,C-N键反应,，,肽合成,C-C键形成,还原反应,氧化反应,异构化反应,C-X反应卤化反应,67/92,C-X反应卤化反应,68/92,酶工程,酶工程定义,化学酶工程,固定化酶,生物酶工程,酶工程应用范围,69/92,酶工程定义,酶工程即利用酶催化作用，在一定生物反应器中，将对应原料转化成所需产品。,酶工程是当代酶学理论与化工技术交叉技术，它应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。,70/92,酶工程,酶工程主要研究酶生产、纯化、固定化技术、酶分子结构修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面应用。酶工程主要采取两种方法。,一是化学酶工程,，即经过对酶化学修饰或固定化处理，改进酶性质以提升酶效率和减低成本，甚至经过化学合成法制造人工酶；,另一个是生物酶工程，,即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而声查性能稳定，含有新生物活性及催化效率更高酶。所以酶工程能够说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成新型应用技术。,71/92,酶工程,酶工程定义,化学酶工程,固定化酶,生物酶工程,酶工程应用范围,72/92,化学酶工程,1天然酶,工业用酶制剂大多是经过微生物发酵而取得粗酶，价格低，应用方式简单，产品种类少，使用范围窄。比如洗涤剂、皮革生产等用蛋白酶；纸张制造、棉布退浆等用淀粉酶；漆生产用多酚氧化酶；乳制品中凝乳酶等。天然酶分离纯化伴随各种层析技术及电泳技术发展，得到长足进展，当前医药及科研用酶多数是从生物材料中分离纯化得到。,73/92,化学酶工程,2化学修饰酶,经过对酶分子化学修饰能够改进酶性能，以适合用于医药应用及研究工作要求。化学修饰路径，能够经过对酶分子表面进行修饰，也可对酶分子内部进行修饰。主要方法有：,酶功效基修饰：经过对酶功效基化学修饰提升酶稳定性和活性。比如将-胰凝乳蛋白酶表面氨基修饰成亲水性更强-NHCH2COOH，可使酶抗不可逆热失活稳定性在60时提升了1000倍。,交联反应：用一些双功效试剂能使酶分子间或分子内发生交联反应而改变酶活性或稳定性。比如将人-半乳糖苷酶A经交联反应修饰后，其酶活性比天然酶稳定，对热变性与蛋白质水解稳定性也显著增加。若将两种大小、电荷和生物功效不一样药用酶交联在一起，则有可能在体内将这两种酶同时输送到同一部位，提升药效。,大分子修饰：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇等可修饰酶蛋白侧链，提升酶稳定性，改变酶一些主要性质。如-淀粉酶与葡聚糖结合后热稳定性显著增加，在65结合酶半衰期为63min，而天然酶半衰期只有2.5min。,74/92,酶工程,酶工程定义,化学酶工程,固定化酶,生物酶工程,酶工程应用范围,75/92,固定化酶,固定化酶（immobilized enzyme），是用物理或化学方法处理水溶性酶使之变成不溶于水或固定于固相载体但仍含有酶活性酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，轻易与水溶性反应物分离，可重复使用。固定化酶不但仍含有酶高度专一性和高催化效率特点，且比水溶性酶稳定，可较长久使用，含有较高经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内酶模拟，可有利于了解微环境对酶功效影响。,固定化酶在文件中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。,酶催化反应依赖于它活性部位完整性，所以在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位基因不受影响，并防止高温、强酸及强碱等条件，不使蛋白质变性。,76/92,固定化酶,载体结正当：最惯用是共价结正当，即酶蛋白非必需基团经过共价键和载体形成不可逆连接。在温和条件下能偶联蛋白质基团包含：氨基、羧基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基、酪氨酸酚基、丝氨酸和苏氨酸羟基。参加和载体共价结合基团，不能是酶表现活力所必需基团。,交联法：依靠双功效团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采取双功效团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参加交联反应。,包埋法：酶被裹在凝胶细格子中或被半透性聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，比如可用明胶及戊二醛包埋含有青霉素酰化酶活力菌体，工业上用于生产6-氨基青霉烷酸。,酶经过固定化后,比较能耐受温度及pH改变，最适pH往往稍有移位,对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提升几十倍（如 5-磷酸二酯酶工业应用）甚至几百倍,77/92,固定化酶,固定化酶形式多样，可制成机械性能好颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有些人用酶膜（包含细胞、组织、微生物制成膜）与电、光、热等敏感元件组成一个装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息传递及环境保护中有害物质检测。最惯用是酶膜与离子选择电极组成生物传感器，比如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则经过氧电极反应出电流改变，用以计算脲含量。,78/92,酶工程,酶工程定义,化学酶工程,固定化酶,生物酶工程,酶工程应用范围,79/92,生物酶工程,生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来，是以酶学和DNA重组技术为主当代分子生物学技术相结合产物。所以它亦可称为高级酶工程。,自从70年代初DNA重组技术问世以来，把酶学推进到一个十分主要发展时期，使它基础研究和应用研究领域发生着巨大革命性改变，产生了生物酶工程。,生物酶工程主要包含三个方面：(1)用DNA重组技术(即基因工程技术)大量地生产酶(克隆酶)；(2)对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶(突变酶)；(3)设计新酶基因，合成自然界不曾有过、性能稳定、催化效率更高新酶。,80/92,酶基因克隆和表示技术应用使我们有可能克隆各种天然蛋白基因或酶基因。先在特定酶结构基因前加上高效开启基因序列和必要调控序列，再将此片段克隆到一定载体中，然后将带有特定酶基因上述杂交表示载体转化到适当受体细菌中，经培养繁殖，再从搜集菌体中分离得到大量表示产物我们所需要酶。一些来自于人体酶制剂，如治疗血栓栓塞病尿激酶原，就能够用此法取代从大量人尿中提取。另外还有组织纤溶酶原激活剂(TPA)与凝乳酶等一百各种酶基因已经克隆成功，其中一些还已进行了高效表示。此法产生出大量酶，并易于提取分离纯化。,81/92,近几年兴起另一个新研究领域：酶选择性遗传修饰，即酶基因定点突变。研究者们在分析氨基酸序列搞清酶一级结构及X线衍射分析搞清酶空间结构基础上，再在由功效推知结构或由结构推知功效重复推敲下，设计出酶基因改造方案，确定选择性遗传修饰修饰位点。现在人们已掌握技术，所以只要有遗传设计蓝图，就能人工合成出所设计酶基因。酶遗传设计主要目标是创制优质酶，用于生产昂贵特殊药品和超自然生物制品，以满足人类特殊需要。,82/92,需要改进酶学性质包含：对热、氧化剂、非水溶剂稳定性；对蛋白水解作用敏感性；免疫原性；最适pH、离子强度及温度；催化效率；对底物和辅助因子专一性与亲协力；反应主体化学选择性；催化效率；别构效应；反馈抑制；多功效性；在纯化或固定化过程中酶功效和理化性质等。当前关键问题在于怎样设计超自然优质酶基因，即怎样作出优质酶基因遗传设计蓝图。,83/92,酶工程,酶工程定义,化学酶工程,固定化酶,生物酶工程,酶工程应用范围,84/92,酶工程应用范围,对生物宝库中存在天然酶开发和生产；,自然酶分离纯化及判定技术；,酶固定化技术（酶和细胞固定化）；,酶反应器研制和应用；,与其它生物技术领域交叉和渗透。,其中固定化酶技术是酶工程关键。实际上有了酶固定化技术，酶在工业生产中利用价值才真正得以表达。,85/92,实例 1,酶工程产品益生源，用于饲料添加剂,86/92,实例 2,酶工程产品万寿胶囊,用于补充人体营养物质,87/92,实例 3,生态复合酶制剂，用于改进环境,88/92,实例 4,酶工程 化装品原料,89/92,实例 5,酶反应器，用于污水处理,90/92,当前酶工程研究热点,研制分解纤维素和木质素酶、低分子有机物聚合酶、,检测用酶、能分解有毒物质酶及废物综合利用酶。,利用基因工程技术开发新酶品种和提升酶产量。,固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅因子再生体系，特定,生物反应研究和应用。,用微生物和动植物组织硕士物传感器。,非水系统反应技术，酶分子修饰与改造以及酶型高效催,化剂人工合成研究。,91/92,1、非水相酶学应用领域包含哪些方面？,2、常见非水相酶学反应体系有哪些？,3、名词：反相胶束体系、对映体特异性、潜手性特异性、位置特异性、化学键特异性、pH记忆、疏水参数,4、反相胶束体系作为反应介质优点？为何？,5、非水相酶促反应优点？,6、酶在非水相环境中保持活性，原因是什么？怎样解释？,7、非水相环境对酶热稳定性有什么影响？为何？,8、怎样了解水与酶柔性、有机溶剂与酶刚性之间关系？,9、有机溶剂对酶催化反应影响表现在哪些方面？,10、通常，疏水参数与酶活性之间有何关系？,11、什么是溶剂工程？理论依据是什么？,12、与水相比，有机溶剂对酶活性调整有何表现？为何？,13、非水相中惯用酶和反应类型有哪些？,思索题,92/92,
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