李若瑜-药敏试验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,内 容,药敏试验的常用方法及应用,抗真菌药物的耐药监测现状,抗真菌药物的耐药机制研究近况,抗真菌药物的种类,麦角固醇,多烯类,如 两性霉素,B,唑类,如 氟康唑,伊曲康唑,伏立康唑,泊沙康唑,核苷类,如 5-氟胞嘧啶,角鲨烯,羊毛甾醇,K,+,Mg,2+,丙烯胺类,如 特比萘芬,乙酰辅酶,A,棘白菌素,类,如 卡泊芬净,米卡芬净,安尼芬净,尼可霉素,核酸合成,葡聚糖合成,甲壳质合成,侵袭性真菌感染逐渐增多,念珠菌院内感染第位的病原菌,曲霉第,2,位的病原真菌,接合菌,(,毛霉,),隐球菌,药敏试验的作用,评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药,;,检测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性,;,指导临床用药的选择,监测疗效,发现耐药株,.,药敏试验测定方法,液基稀释法,CLSI M27-A3,，,M38-A2,琼脂稀释法,纸片扩散法,CLSI M44-A2,E,test,法,ATB Fungus2,3,联合用药：棋盘法,棘白菌素类,标准化的药敏方法日趋成熟,CLSI（NCCLS)制定的标准被普遍接受,M27A3 酵母菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 _棘白菌素类折点,M38A2丝状真菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 _新质控株、皮肤癣菌,M44A2酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验,EUCAST,标准（,European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing,）与CLSI取得一致,酵母菌药敏试验,建立了对以下药物的测定方法,:,氟康唑、伊曲康唑、,5-FC,、两性霉素,B,、伏立康唑,;,体外,-,体内疗效关系已初步建立,特别对氟康唑,;,已提出判定折点及其解释,.,丝状真菌药敏试验,产孢菌种已建立方法,;,针对目前临床常用药物,(,棘白菌素,);,但尚未建立折点,;,体外,体内,的一致性尚在探讨中,;,检测,烟曲霉菌,对唑类药物的敏感性有意义,;,两性霉素,B,解释仍然困难,;,详细鉴定到种水平是必要的,;,如,土曲霉,尖端赛多孢子菌,和,多育赛多孢,一般对两性霉素,B,耐药,.,Etest,和其它商品化方法,优点,:,使用简便；,对酵母菌比较稳定,丝状菌尚在研究中；,与,CLSI,方法有较高一致性；,但对唑类的,MICs,常由于存在拖尾难以判断；,其它的快速检测试剂尚需进一步验证,如,ROSCO,纸片法。,判断抗真菌药的敏感性和耐药性,CLSI方案测定念珠菌体外敏感试验折点,MIC（,g/ml）,敏感,S,剂量依赖性敏感,SDD,中介,I,耐药,R,氟康唑,=64,伊曲康唑*,1,氟胞嘧啶,32,伏立康唑,=4,*,数据主要基于粘膜疾病,M-44A方案测定,念珠菌体外敏感试验,折点,抑菌菌直径（,mm）,敏感,S,剂量依赖性敏感,SDD,耐药,R,氟康唑,Fluconazole,=19,15-18,=17,14-16,=13,药敏试验的应用指征,尽可能将临床分离株鉴定到种；,意义：曲霉中敏感性不同，土曲、新种,无菌部位的念珠菌，常规做氟康唑和,5-FC,药敏；,黏膜感染，治疗失败后应行药敏；,天然耐药者不测,.,内 容,药敏试验的常用方法及应用,抗真菌药物的耐药监测现状,抗真菌药物的耐药机制研究近况,ARTEMIS DISK,药敏监测,来自全球,40,个国家,134,个研究点,氟康唑,:205,329,株酵母菌,(1997,至,2005),；,伏立康唑,:147,776,株酵母菌,(2001,至,2005),；,方法：,CLSI M44-A,纸片扩散法,结果：,BIOMIC,图象分析系统自动判读。,Pfaller et al.J Clin Microbiol 2007,Vol.45,P.1735-45,ARTEMIS DISK,监测结果,90.1%,的念珠菌株对氟康唑敏感，,22,个种中有,10,个种出现敏感性降低,(,敏感度,75%),，对氟康唑耐药的种主要为光滑念珠菌和克柔念珠菌。,94.8%,的念珠菌对伏立康唑敏感，,3.1%,耐药。对氟康唑耐药的白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和皱落念珠菌菌株中对伏立康唑保持敏感的比例不足,30%,。,非念珠菌酵母菌,(8,821,株,),，对氟康唑不敏感，除红酵母菌对伏立康唑敏感。,本研究证实了唑类药物对临床最常见酵母菌的广谱抗菌活性，但也发现一些少见酵母菌的敏感性下降。,Pfaller et al.J Clin Microbiol 2007,Vol.45,P.1735-45,念珠菌血症病原菌的药敏,China-Scan,项目：,2009,年,11,月至,2011,年,4,月，全国,63,家医院,67,个,ICU,病房共同参加，,249,例念珠菌血症,了解我国,ICU,患者中侵袭性念珠菌血症病原菌的体外药物敏感性特征,判断抗真菌药的敏感性和耐药性,MIC（,g/ml）,敏感,S,剂量依赖性敏感,SDD,中介,I,耐药,R,氟康唑,=64,伊曲康唑*,1,氟胞嘧啶,32,伏立康唑,=4,*数据主要基于粘膜疾病,The CLSI breakpoint for echinocandins=2,g/ml,药敏试验结果,（MIC90）,菌种,/药物,FLC,（,g/ml）,ITC,（,g/ml）,VRC,（,g/ml）,CAS,（,g/ml）,C.a,8,2,0.25,0.5,C.p,16,2,0.5,1,C.t,8,2,0.5,0.5,C.gl,64,4,2,0.5,C.h,32,4,1,1,others,32,2,0.5,1,%,%,g/ml,%,Fluconazole,不敏感念珠菌对,Voriconazole,的药敏数据,Pfaller MA,JCM,2010,48(4):1366,1377,唑类交叉耐药比例升高,全球念珠菌监测体外药敏数据,(1997-2007),荷兰伊曲康唑耐药菌比例有所上升,Year,%R,N,Snelders et al.PLoS Medicine.2008;5:e219.,L98H(TR)was the dominant resistance mechanism,Isolates genetically distinct but clustered.,曲霉临床菌株的分离鉴定,来源：,北大医院皮科真菌室受检标本,时间：,2008年7月到2011年11月,鉴定：,所有菌株均经标准的曲霉鉴定方法进行鉴定，即在麦芽琼脂和查氏琼脂平皿,25度培养7天后，经形态学鉴定（据齐祖同主编中国真菌志-第5卷：曲霉属及其相关有性型，科学出版社，1997年）,菌种分布：,烟曲霉,130株，黄曲霉58株，土曲霉16株，其它9株,药物敏感性测定及结果,测定方法：,CLSI M38-A方案和E-试验,结果,1株烟曲霉对ITC耐药而对VRC敏感,1株烟曲霉对ITC和VRC均耐药,1株黄曲霉对VRC耐药而对ITC敏感,内 容,药敏试验的常用方法及应用,抗真菌药物的耐药监测现状,抗真菌药物的耐药机制研究近况,什么情况下容易发生耐药,?,P.Verweij,TIMM,2007,常见耐药菌及其类型,真菌,AmB,5-FC,唑类,棘白菌素,C.,glabrata,获得性,获得性,C.krusei,获得性,天然,天然,C.lusitaniae,天然,/,获得性,Cryptococcus neoformans,天然,Aspergillus terreus,天然,Scedosporium apiospermum,天然,Scedosporium prolificans,天然,Trichosporon beigelii,天然,ERG11,基因突变,ERG11,基因过表达,ERG3,、,ERG5,基因突变,药物泵基因过表达,念珠菌唑类药物耐药机制,Clin Microbiol Rev 1998;11:382,烟曲霉菌耐药机制,Chamilos G,Kontoyiannis DP.,Drug Resistance Updates 8(2005)344358,AF1,，,2001,年,12,月，第一次就诊；,AF2,，,2002,年,6,月，,ICZ 200mg/d,治疗,6,个月后；,AF3,，,2002,年,8,月，停药,2,个月以后；,ICZ,静脉给药，,200mg bid,治疗两周，然后口服，,200mg/d,继续治疗，其间分离到以下三株：,AF4,，,2002,年,12,月；,AF5,，,2003,年,1,月；,AF6,，,2003,年,2,月；,烟曲霉唑类药物耐药系列分离株,Chen&Li,et al.JAC,2005.,MIC of itraconazole against 6,isolates,Isolate,MIC(mg/L),AF1,0.25,AF2,16,AF3,0.5,AF4,16,AF5,16,AF6,16,AF2的CYP51A第220位蛋氨酸被异亮氨酸替代(M220I),AF4-6的CYP51A第54位的甘氨酸被精氨酸替代(G54R),药物流出泵及唑类药物靶酶基因相对表达水平,Mann P.A,et al,.Antimicrob.Agents Chemother,2003,47:577-581.,Diaz-Guerra T.M,et al.,Antimicrob.Agents Chemother,2003,47:1120-1124,Nascimento A.M,et al.,Antimicrob.Agents Chemother,2003,47:1719-1726,Mellado E.et al.,Antimicrob.Agents Chemother,2004,48:2747-2750,烟曲霉菌,cyp51A 基因突变的报道,有关三唑类耐药的氨基酸替换,氨基酸改变,耐药药物,M220I,M220V,M220K,M220T,伊曲康唑,G54R,G54E,G54K,G54V,伊曲康唑和泊沙康唑,L98H,伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和立福康唑,许多三唑类耐药是因为在,CYP51A,基因启动子 L89H 与2个拷贝的34 bp片段串联相结合。,药物主动外排泵的变化,基因标志,蛋白,参考文献,AfuMDR1,ATP-结合盒超家族,Tobin,M.B.et al gene 1997,AfuMDR2,ATP-结合盒超家族,AfuMDR3,主要辅助因子,超家族转运蛋白,Nascimento A.M.,et al,Antimicrob Agents Chemother,2003,AfuMDR4,ATP-结合盒超家族,AtrF,ATP-结合盒超家族,John W.Slaven et al.,Fungal Genetics and Biology 2002,Update on azole resistance in,Aspergillus fumigatus,曲霉与唑类,In vitro,“,reduced susceptibility,”,remains 0-5%in most large surveys,often using itraconazole,Most data for,A.fumigatus,section,Case reports and case series,suggest that multiply-azole resistant,Aspergillus,could emerge,?association with agricultural azole use,Rodriguez-Tudela,et al.,Antimicrob Agents Chemother.,2008;52:2468.,Verweij,et al.,N Engl J Med.,2007;356:1481-83.,Arendrup,et al.,Antimicrob Agents Chemother.,2008;52:3504-11.,Howard,et al.,Int J Antimicrob Agents Chemother.,2006;28:450-53.,Snelders et al.,PLoS Medicine.,2008;5:e219.,唑类药物对曲霉的流行病学折点,ECV(,g/mL),ITR,PSC,VRC,Species,No.Tested,A.fumigatus,2815,1,0.25,1,A.flavus,592,1,0.5,1,A.niger,520,2,1,2,A.terreus,462,2,0.5,1,Espinel-Ingroff et al.,JCM.,2010;submitted.,Development of Azole resistance of,A.fumigatus,P.Verweij,TIMM,2007,耐药曲霉感染的病例报告（,1）,女性，,10岁，急淋，,在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗细菌、氟康唑预防真菌感染处理；,肺部,CT检示：肺内结节灶；,痰液真菌镜检示：分支分隔的菌丝，培养示烟曲霉，故改用伏立康唑；,治疗9天后，体温38.1度，咳嗽减轻；继续治疗一周后复查CT见肺脏病变减轻不明显，故而给予AMB，20mg/d，一周后无发热、咳嗽，肺内病变未扩大；,继续治疗一周后无明显症状，CT示肺内结节局限，故停用AMB而出院。,临床菌株及药物敏感性特点（,1）,菌株,ITC,VRC,AMB,CAS,AF293,0.5,1,1,0.25,04787-,16,8,1,0.5,04787-,16,2,1,0.25,Repeat numbers of microsatellite loci,A,llelic profile,e,ST,Af,3A,Af,3,B,Af,3,C,Af,4A,Af,4B,Af,4C,ANX4,BGT1,CAT1,LIP,MAT1 2,SODB,ZRF2,31,8,5,7,9,19,2,1,4,1,1,1,1,32,29,8,5,7,9,19,2,1,3,1,1,1,1,9,烟曲霉唑类药物耐药机制（,2）,菌株,ITC（,mg/L,）,VRC（,mg/L）,Cyp51A突变,04787（1）,16,8,TR/L98H,，,Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E，,L307P,04787（2）,16,2,TR/L98H,，,Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E，,F495I,、,S297T,、,L190P,AF2,16,1,M220I,AF4,AF5,AF6,16,0.5-1,G54R,未见以往的,G54、M220、,G448、G138,（,后二者与,ITC及VRC交叉耐药相关,）,Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E:文献报告与耐药无关,TR/L98H:导致ITC耐药、VRC中度敏感；故,L190P与耐药无关，而L307P的作用需阐明,Qiao,2008；Mellado,2007；Howard,2006；Kontoyiannis,2005；Evelline,2008,小 结,体外药物敏感性结果与方法有关,需要统一和,规范；,长期监测意义重要,菌种动态变化和耐药监测；,可以作为临床经验用药的依据；,当治疗效果不满意时应考虑做体外药敏试验；,对于有耐药可能的菌株应及时做药敏试验；,警惕获得性耐药的发生,白念、烟曲霉等。,联系方式,:,lry0660,83573056,谢谢大家,!,