流式基础原理.ppt

Click to add title,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,BD Biosciences,Immune Function,*,BD,公司生物科学部,技术支持 蔡英,Tel,：,13811403423,流式基础原理,To help all people live healthy lives,成立于,1897,年，位居财富周刊,500,强,产品涵盖诸多医疗领域：注射器、真空采血管、流式细胞仪,1973,年,BD,推出世界第一台流式细胞仪,FACS I,1980,年中国的第一台流式细胞仪,FACS II,生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域,BD FACS,流式细胞仪市场占有率：全球,75%,，中国,80%,流式基本概念,流式细胞术的基本概念,流式细胞术,（,Flow,Cytometry,简称,FCM,）,是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线,流动状态,中的,单个细胞,的多项物理及生物学特性，加以,分析,定量的技术，,同时可以对特定群体加以,分选,。,流式细胞仪,（,Flow,Cytometer,）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式检测的样本,可检测的样本种类多样：,各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等,New!,血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,样本制备：,单细胞悬液（天然，机械研磨,/,消化）,510,5,110,6,cells/ml,，约,0.5,1ml,，,300,目筛网过滤,流式细胞仪的检测范围,细胞结构,细胞大小,细胞颗粒度,细胞表面积,核浆比例,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,蛋白质含量,细胞功能,细胞表面,/,胞浆,/,核的特异性抗原,细胞活性,细胞内,/,外的细胞因子,激素结合位点、细胞受体,蛋白磷酸化,pH,值,钙离子浓度,细胞膜电位、线粒体膜电位,散射光信号,Right Angle Light Detector,Cell Complexity,SSC,Forward Light Detector,Cell Surface Area,FSC,Incident Light Source,前向角散射光（,FSC,Forward Scatter）,细胞相对大小及其表面积,侧向角散射光（,SSC,Side Scatter）,细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,前向角散射光信号,侧向角散射光信号,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,颗粒杂质、气泡,对检测的影响,荧光信号,使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析,荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光样本制备,双色直接染色,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（,nm,）,激发光谱（,Excitation,，,Ex,）：,是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。,吸收波峰（最大吸收波长）：,Ex-Max,发射光谱（,Emission,，,Em,）：,是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光,发射波峰（最大发射波长）：,Em-Max,荧光素的使用：,选择正确的激光器,确定所需探测器（,PMT,）,区别,488nm 520nm,异硫氰酸荧光素（,FITC,）,光学系统：滤光片,如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？,滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围,Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP),460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP 500/50,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,Fluorescence Spectrum Viewer,流式数据分析形式,数据存储,FCS 2.0,格式,常以列表模式（,LIST MODE),：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE,双染样本,数据显示,直方图（,Histogram,）,二维点图（,Dot Plot,）,等高线图（,Contour Plot,）,密度图（,Density,）,三维图（3,D Plot,）等,单参数直方图分析,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目,双参数散点图分析,等高图和密度图,流式细胞仪的组成和工作原理,流式对照的设置,荧光染色对照的设置,1,阴性对照,空白对照,自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强,实验样本,特异荧光，即抗体,F(ab)2,段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光,非特异荧光，即抗体,Fc,段与细胞表面的,Fc,受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光,自发荧光特异荧光非特异荧光,同型对照（自发荧光非特异荧光）,合适？,同型对照,同型对照（,Isotype Control,）：,与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型,（即,Fc,段相同，,F(ab)2,段不同）,与染色的单克隆抗体,相同种属来源,相同免疫球蛋白及亚型,相同荧光素标记,相同剂量和浓度,但由未免疫动物血清纯化而来,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的,Fc,受体而产生的背景染色,例如，标记,FITC,的单克隆抗体为小鼠,IgG1,亚类抗体，标记,PE,的单克隆抗体为小鼠,IgG2a,亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化,IgG1,（,1,）和,IgG2a,（,2a,），并分别标记,FITC,和,PE,商业化荧光素的发射光谱,spectral overlap,Fluorescence Spectrum Viewer,spectral overlap,如何解决？,荧光染色对照的设置,2,补偿对照（,双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时,）,荧光补偿（,compensation,）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（,spectral overlap,）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号,已染色样本？,真双阳？假双阳？,双色荧,光补偿,1,双色荧,光补偿,2,双色荧,光补偿,3,荧光染色对照的设置,2,补偿对照（,双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时,）,荧光补偿（,compensation,）,使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色,几色分析需要制备几个补偿对照管,分析类型,管,功能,加入的抗体,双色分析,1,Isotype,1-FITC,2a-PE,2,Compensation1,A-FITC,2a-PE,3,Compensation2,1-FITC,B-PE,4,Sample1,2,A-FITC,B-PE,No.,Antibody,Isotype,Mouse,anti-human,未免疫,Mouse,血清纯化而来,1,A-FITC,（,1,）,1-FITC,2,B-PE,（,2a,）,2a-PE,流式网络资源,关键词搜索：,FCM,，,FACS,，流式,.cn,（中文）,白血病免疫分型,FAB,分型：,AL,分为,AML（M,0,-M,7,）&ALL,白血病的,MICM,分型,Morphology,Immunology,Cytogenetics,Moleculor Genetics,白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是,MIC,分型的重要组成部分，也是对,FAB,分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用,。,白血病细胞特性：,白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常,异常抗原表达(,Aberration Antigen Expression),丧失系列规律性（,lineage infidelity),过高，过低，不表达，交叉,丧失分化发育的阶段性（,differentiation asynchrony),早期与晚期抗原同表达,白血病免疫分型抗原,常用白血病细胞系列与分化阶段抗原,白血病细胞系列非特异性抗原：,干/祖细胞：,CD34+、HLA-DR+、CD38-,原始细胞：,CD34+、HLA-DR+、CD38+,幼稚细胞：,CD34-、HLA-DR-、CD38+,白血病细胞,系列抗原,分化阶段抗原,T,淋巴细胞白血病,CD3、CD5、CD7,CD4、CD8,B,淋巴细胞白血病,CD10、CD19、CD22、CD79a,CD20、CyIg、Cy、SmIg,髓系白血病,CD13、CD33、MPO,CD14、CD15,红白血病,GlyA（,血型糖蛋白,A）,巨核细胞白血病,CD41、CD42、CD61,注：,CyIg（,胞浆免疫球蛋白）、,Cy（,胞浆,链）、,SmIg（,表面膜免疫球蛋白）,MPO（,髓过氧化物）、,CD7,可在部分髓系白血病细胞表达,白细胞共同抗原：,CD45,CD45,的临床应用,所有人类白细胞均表达,CD45,，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞以及骨髓前体细胞等。造血系统细胞,CD45,表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即,分化程度高的细胞,CD45,表达量高，分化程度低的细胞,CD45,表达量低（淋巴细胞,单核细胞,成熟粒细胞,原幼细胞，在红细胞中不表达；,SSC,是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞,单核细胞,原幼细胞,淋巴细胞）,。目前，国际上采用,CD45/SSC,设门,，可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,CD45,的临床应用,用,CD45-SSC,设门寻找异常细胞，将细胞分为,5,个群体,，当幼稚细胞达,70-80%,时，即可大致估计,AL,的类型,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T,淋巴细胞：,CD45+、CD3+/CD4+,、,CD3+/CD8+,、,CD5+/CD7+,，部分细胞,CD,（,16+56,）,+,，无,CD4+CD8+,双阳性细胞,B,淋巴细胞：,CD45+、CD10-/CD19+,、,CD20+/CD22+,、,HLA-DR+/CD13-,NK,细胞：,CD45+,、,CD,（,16+56,）,+/CD3-,单核细胞：,CD45+,、,HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+,中性粒细胞：,CD45+、HLA-DR-/CD13+,、,CD14-/CD33+,，,CD13,比,CD33,表达更高,嗜酸性粒细胞：,CD45+、HLA-DR-/CD13+,、,CD14-/CD33+,，,CD13,比,CD33,表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,急性,T,淋巴细胞白血病（,T-ALL）,骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（,AML-M3）,骨髓细胞免疫分型散点图,FCM,在临床血液学中的应用,能正确区别,AML,和,ALL,，并能进一步区别,ALL,中的,T,系和,B,系及亚型,能正确鉴别,AML,中难于鉴别的,M0,、,M6,、,M7,诊断双系或双表型白血病,发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病,诊断少见疑难白血病（如,HCL,）,免疫分型 对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病,形态学为急性淋巴细胞白血病（,ALL）,或急性未分化白血病（,AUL）,但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记,混合性白血病,部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。,慢性淋巴细胞白血病,微小残留白血病,