无菌保障微生物发酵工程.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,Company Logo,6,无菌保障,Company Logo,；,无菌的保障,设备无死角,种子，培养过程加入的物料无污染。,培养基和生产环境灭菌,好氧发酵过程空气除菌；,Company Logo,灭菌（除菌）的方法,培养基湿热灭菌,空气过滤除菌,发酵的污染与防治,6,无菌保障,Company Logo,灭菌,：用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切生命的过程。,一些化学药剂能,使微生物中的蛋,白、酶及核酸,发生反应。乙醇，,甲醛，氯，高锰,酸钾，环氧乙烷，,季銨盐，臭氧等。,主要用于器械和,环境灭菌和消毒,化学灭菌,1,160,下保温,1-2h,。要求保,持干燥的器具,和材料。,干热灭菌,3,4,利用饱和蒸汽进行灭菌。有效，使用广泛。,2,利用电磁波、紫外线、,x,射线、,r-,射线等,射线灭菌,湿热灭菌,过滤除菌利用过,滤方法截流微生,物，达到除菌的,目的。适用于热,敏性培养基和制,备无菌空气,过滤除菌,3,Company Logo,原理,：,当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质和酶的基本成分,-,蛋白质发生不可逆的变化，使微生物在很短时间内死亡。,以能否杀死芽孢细菌为,标准,。,杀死微生物的极端温度称为,致死温度,。,在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为,致死时间。,6.2,培养基湿热灭菌,Company Logo,培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比,。,即：,dN/dt=-kN,式中：,N-,培养基中残留活菌数（个）,t-,受热时间（,min,）,k-,反应速率常数或比死亡速率（,min,-1,）,一微生物的死亡速率与理论灭菌时间,Company Logo,若开始灭菌时（,t=0,），培养基中微生物的数量为,N,0,，将上式积分得,：,lnN/N,0,=-kt,N=N,0,e,-kt,(,对数残留定律,),lnN/N,0,=-kt,t=1/k ln N,0,/N,t,t=(2.303/k)X lg N,0,/N,t,计算时，,N,t,一般可取,0.001,，,N,0,可参照一般培养基中活微生物数，取（,1-2,）,X10,7,而得,。,Company Logo,灭菌,时间,污染程度,灭菌程度,k,值,通常,110-130,，,5-20min,培养液采用高温短时间加热的方式，可以达到彻底灭菌并且减少对培养液成分的破坏。,Company Logo,k,微生物种类,加热温度,K,值越大，微生物越容易死亡,Company Logo,即,:,k=Ae,-E/RT,式中：,A-,频率因子,E-,杀死微生物所需的活化能,R-,气体常数，,8.314 J/,（,mol,K,）,Lg k=-1 E/2.303 RT+lg A,耐热芽孢杆菌,A,取作,1.34X10,36,s,-1,E,取,2.844X10,5,J/mol,k,值随着温度的变化遵循阿仑尼乌斯定律,Company Logo,E,和,A,的求得：,以,Lg k,与,1/T,作图，得一直线，从直线的斜率和截距求得,E,和,A,。,进而根据灭菌温度可以求出,k,值，并计算出,灭菌时间。,一般杀灭微生物,营养细胞的,E,值约为,2.09X10,5,-2.71X10,5,J/mol,杀死微生物,芽孢,的,E,值约为,4.48X10,5,J/mol,。,Company Logo,因为加热灭菌过程中对培养基的破坏反应的速率常数也符合阿仑尼乌斯定律，同理计算出了培养基中,某营养成分分解的,E,，,值,。,一般,酶和维生素,等营养成分分解的,E,，,值为,8.36X10,3,-8.36X10,4,。,Company Logo,由于灭菌时杀死微生物的活化能,E,值,大于,培养基营养成分破坏的活化能,E,，,值，因此随着温度的升高，灭菌速率常数增加的倍数,大于,培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。,lnk,2,/k,1,E,lnk,2,/k,1,E,，,因此较高的灭菌温度，较短的灭菌时间能减少培养基营养成分的损耗。,Company Logo,Company Logo,1,分批灭菌，不计升温阶段所杀灭的菌数，,t=(2.303/k)lg N,0,/N,t,例,1,有一发酵罐内装,40m,3,培养基，在,121,温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每,1mL,有,2X10,5,个耐热细菌芽孢，,121,时灭菌速率常数为,1.8min,-1,求,灭菌失败几率为,0.001,时所需要的灭菌时间,解：,N,0,=40 X10,6,X 2 X10,5,=8X 10,12,个,N,t,=0.001,个,K=1.8 min,-1,灭菌时间：,t=2.303/1.8 lg,（,8X 10,12,/0.001,）,=,20.34min,二培养基灭菌时间的计算,Company Logo,例,2,.,若将例,1,中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度,131,，此温度下灭菌速率为,15min,-1,。求灭菌所需的维持时间。,解：,C,0,=2X10,5,(,个,/ml),Cs=1/40X10,6,X1000=2.5X10,-11,(,个,/ml),灭菌所需的时间,t=2.303/15 lg,（,2X 10,5,/2.5X10,-11,）,=2.37min,Company Logo,1,分批灭菌,：,将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪器灭菌的操作过程，也称,实罐灭菌。,分批,灭菌,优点,缺点,设备投资少，灭菌效果可靠，,对蒸汽要求低（,0.2-0.3MPa,）。,培养基破坏作用大，,操作难于自动化。,三培养基的灭菌：,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温，保温，冷却的过程进行灭菌。,2.,连续灭菌,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,灭菌（除菌）的方法,培养基湿热灭菌,空气过滤除菌,发酵的污染与防治,6,无菌保障,Company Logo,6.3,空气过滤除菌,一、发酵用无菌空气的质量标准,:,发酵用的无菌空气,就是将自然界的空气经过压缩,冷却,减湿,过滤等过程,达到,:,Company Logo,1,连续提供一定流量的压缩空气。,2,空气的压强为,0.2-0.4Mpa,3,进入过滤器之前，空气的相对湿度,70%,4,进入发酵罐的空气温度可比培养温度高,10-30,5,压缩空气的洁净度一般以失败概率为,10,-3,为指标。,Company Logo,空气净化的方法,热灭菌法,静电除菌,介质过滤,辐射杀菌,Company Logo,二,.,空气除菌设备,Company Logo,三,.,空气净化的流程,1.,空气的预处理,1).,采风塔,:,10m,上风头,流速,8m/s.,2).,粗过滤器,:,前置过滤器,拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机,同时减轻总过滤器的负担,.,过滤介质采用泡沫塑料或无纺布,.,实际流速为,0.1-5 m/s.,3).,空气压缩机,:,提供动力以克服随后各设备的阻力,.,4).,空气贮罐,:,主要为消除压缩机空气的脉动,特别是对于往复式空压机,.,Company Logo,5).,冷却器,:,温度,120,左右,必须冷却。降湿。,6).,气液分离设备,:,除去空气中的水和油保护过滤介质,.,有利用离心力沉降的旋风分离器,和利用惯性拦截的介质分离器,.,旋风分离器,：,利用离心力进行气液和气固沉降分离的设备。结构简单，阻力小，分离效率高。可去除空气中绝大多数的,20,m,以上的液滴。但是,10m,左右的液滴，除去效率只有,60-70%,。,丝网除沫器,：,可除去,1m,以上的雾滴，去除率为,98%,。,7,）,.,空气加热设备,此时的压缩空气湿度为,100%,Company Logo,Company Logo,Company Logo,2,空气的过滤除菌,过滤,介质,绝对过滤,深度过滤,介质的空隙小于被拦截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纤维素酯材料做成的微孔滤膜。,介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质有一定厚度，机理是静电，扩散，惯性及拦截作用。如棉花过滤器，超细玻璃纤维纸，金属烧结管等。,Company Logo,1).,纤维及颗粒状介质的过滤器：用于总过滤器。,Company Logo,棉花,：,未脱脂棉花，纤维直径为,16-20m,，其实密度为,1520Kg/m,3,。填充率为,8.5-10%,。,玻璃纤维,：,用无碱的玻璃纤维介质作为过滤介质。纤维直径为,3-20m,，其实密度为,2600Kg/m,3,。填充率为,5-11%,。,活性炭,：,常与纤维状介质分层堆放成过滤床。,通过过滤器的气流速度一般为,0.2-0.3m/s,相应的压力降也较小。,Company Logo,Company Logo,过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入,0.2-0.4 Mpa,的蒸汽，灭菌,45min,后用压缩空气吹干备用。总过滤器约每月灭菌一次。,Company Logo,介质,:,超细玻璃纤维纸。,孔径,:,1-1.5m,厚度,:,0.25-0.4mm,实密度,:,2600Kg/m,3,填充率,:,14.8%,。,除菌效率高，阻力小，强度低。,用酚醛树脂，甲基丙烯酸树脂等处理以提高防湿能力,用多孔板夹住提高其抗冲击能力。,2).,滤纸过滤器：,Company Logo,Company Logo,3,）金属烧结管空气过滤器：,压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管的壁除去杂菌和颗粒，得到的无菌空气由管程排出。,使用寿命长，耐高热，气体阻力小，安装维修方便。,空气预过滤器和蒸汽过滤器。,Company Logo,4,）微孔膜过滤器,-,绝对过滤器：,由耐高温，疏水的，厚度为,150m,的聚四氟乙烯薄膜构成。能绝对滤除所有的大于,0.01m,以上的微粒，能除去几乎所有空气中夹带的微生物。,过滤器体积小，处理量大，压降小，除菌效率高,Company Logo,Company Logo,3,空气净化的流程,：,粗,过,滤,器,一,级,冷,却,器,空,气,加,热,器,分,过,滤,器,无,菌,空,气,二,级,冷,却,器,分,水,器,空,气,贮,罐,旋,风,分,离,器,空,气,压,缩,机,丝,网,除,末,器,空,气,吸,气,口,总,过,滤,器,Company Logo,1,）,.,两级冷却，加热除菌流程,特点,：,两次冷却，两次分离，适当加热。,适应性广，充分分离油水，节约冷却水。,Company Logo,2,）,.,冷热空气直接混合式空气除菌流程,特点：,省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿度的地区。,Company Logo,3,）,.,高效前置过滤空气除菌流程,Company Logo,4,影响介质过滤效率的因素：,介质过滤效率指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比。,=N,1,-N,2,/N,1,过滤,效率,纤维,直径,填充,密度,空气,流速,滤层,厚度,Company Logo,如何提高,过滤除菌,效率,设计合理,预处理设备,选择合适,净化流程,保证进口,空气的洁,净度。,降低空气,相对湿度,保证过滤,介质干燥,合理空气,过滤器，除,菌效率,高的过滤,介质,其它设备及管道灭菌,种子罐,补料罐,管道,阀门,Company Logo,Company Logo,6.4,发酵的污染与防治,发酵染菌,:,指在发酵过程，生产菌以外的其它微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种发酵。,Company Logo,一,.,染菌对发酵的影响,1,染菌对不同发酵过程的影响,由于各种发酵过程所用的微生物,菌种,，,培养基,以及,发酵条件,，,产物,的性质不同,，,染菌造成的危害程度也不同。,长势弱,的营养缺陷型菌种的发酵易污染,有机酸,发酵的杂菌生长相对困难。,发酵,产物易,被杂菌,分解,的污染损失大,。,Company Logo,2,染菌发生的不同时间对发酵的影响,种子培养期,发酵,前期,发酵,中期,发酵后期,危害大，严格控制。,污染的种子液应灭菌后除去，并对相应的设备进行消毒。,易染菌，,危害大,难挽救，早发现，早处理,相对来说，危害小。,可继续发酵,Company Logo,1,种子培养和发酵的异常现象,异常指发酵过程中的某些物理参数，化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变。,二发酵异常现象及原因分析,Company Logo,1,）种子培养异常：种子质量不合格。,Company Logo,菌体生长缓慢：,Company Logo,菌丝结团：,原因,种量低,保藏时间长,菌龄短,溶解氧不足,培养基质量,Company Logo,糖和氨基酸等变化不正常，菌体浓度和代谢产物不正常。,原因,：,可能是接种物或培养基的质量差，接种量小，杂菌污染等。,代谢不正常：,Company Logo,发酵异常,发酵异常,的表现,pH,值过高,或过低,1,可能是菌体,生长差，代,谢速度慢，,种子过嫩或,过老，蛋白,质等胶体多，,灭菌时间过,长或温度过,高等。,泡沫过多,3,4,温度异常，溶解氧异常，灭菌不当，种子质量差等,2,染菌发,生的表现,溶解氧,水平异常,菌体浓度,过高或过低,Company Logo,2,染菌的检查与判断,最简单，,最直接，,最常用,镜检法,肉汤,培养法,平板划线培,养或斜面培,养检查法,Company Logo,主要原因是,：,设备渗漏，空气净化达不到要求，种子带菌，培养基灭菌不彻底和技术管理不善等。,3,原因分析,Company Logo,芽孢杆菌,球菌等不耐热的,灭菌不彻底引起的,种子带菌,除菌不彻底,设备渗漏,真菌,设备或冷却管漏,无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当,糖液灭菌不彻底,1,）从杂菌种类分析：,Company Logo,大批量发酵罐染菌,：,前期，可能是种子带菌或连消设备引起污染；中，后期且杂菌类型相同，空气过滤系统有问题。,部分发酵罐染菌,:,前期，种子染菌，连消系统灭菌不彻底；后期，补料染菌或补料管渗漏。,个别发酵罐连续染菌,：,设备原因。,2,）从发酵染菌的规模分析,Company Logo,三杂菌污染的途径和防治,1,种子带菌及其防治：,原因,保藏斜面,菌种染菌,种子转移和,接种过程染菌,种子培养涉及的,设备和装置染菌,培养基和器,具灭菌不彻底,Company Logo,防治,控制无,菌室的污染,种子的培养,严格的无菌检查,严格培养基,或器具灭菌,严格管理沙土管,斜面及三角瓶,Company Logo,必须从空气的净化工艺和设备的设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。,2,空气带菌及其防治：,Company Logo,减少空气的含,菌数,提高进气的质量,：,提高,采风口,的位置,安装,粗过滤器,。,减少空气带油，水量,提高进过滤器的空气温度,降低空气的相对湿度,保持过滤介质干燥状态,防止冷却水进入空气系统。,合理空气预处理工艺,Company Logo,Company Logo,3,操作失误导致染菌及其防治,操作,配料和灭菌升温,不当产生“夹生”,泡沫,监测元件,灭菌不彻底,灭菌时形,成“假压”,Company Logo,4,设备渗漏或,“,死角,”,造成的污染及其防治,设备渗漏,：,发酵罐，补料罐，冷却管和管道阀门出现微小的漏孔，发生渗漏,。,原因,：,由于操作，设备结构，安装及其他人为的因素造成的屏障大等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，而不能达到彻底灭菌的目的。,Company Logo,5,噬菌体污染及其防治,噬菌体污染的条件,：,噬菌体，活菌体，以及二者接触的机会和环境。,预防,：,严格活菌体排放；做好环境卫生；严格噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐；抑制罐内噬菌体的生长,。,生产中,对染菌罐的处理,：,并罐法；轮换使用菌种或使用抗性菌株；放罐重消法；罐内灭噬菌体法。,Company Logo,1,）,种子培养期染菌的处理,：,染菌的种子灭菌后弃之并对相应的的设备和管线灭菌。采用备用种子或进行,“,倒种,。,2,）,发酵前期染菌的处理,：,一般视碳，氮含量而定。或灭菌后重新接种或补充一定新鲜培养基或通过调整补料量和时间。,3,）,发酵中，后期染菌染菌处理,：,设法抑制杂菌的生长速度。,4,）,染菌后设备的处理,：,彻底清洗，空罐蒸汽灭菌处理或甲醛熏蒸处理。,6,杂菌污染的挽救和处理,