第5章细菌形态学检查.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细 菌形态学检查,形态学检查分类,一、不染色标本检查(活体）,悬滴法,压滴法,二、染色标本检查,单染法：简单染色，一种染料（美兰染色）,复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染 色、抗酸染色）,染色标本检查法的一般步骤,一、涂片制备,涂片 干燥 固定,二、染色,初染 媒染 脱色 复染,注：固定的目的,1、杀死细菌,保持细菌原有的形态和结构,2、增加细菌的通透性，使细菌易于着色,3、使细菌牢牢地黏附在玻片上，不至于在染色,过程中被水冲掉,1、通透性学说,2、等电点学说,3、化学学说,二、原理,通透性学说,G,+,菌,细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易进入,G,-,菌,细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易渗入。,等电点学说,G+菌,等电点（pI23）,G-菌,等电点（pI45）,在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。,化学学说,G+菌,菌体内含有大量,核糖核酸镁盐,，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色,G-菌,菌体内含,核糖核酸镁盐,很少，故易被脱色,1、菌种,葡萄球菌 大肠杆菌,2、试剂 革兰染色液,初染液 结晶紫,媒染液 卢戈氏碘液,脱色液 95%乙醇,复染液 稀释石碳酸复红,3、其它,载玻片 染色盘 接种环 酒精灯等,三、器材和试剂,冲洗,染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果,四、方法与步骤,1min,1min,30s,30s,冲洗,冲洗,冲洗,1、细菌涂片的制备,涂片 干燥 固定,2、染色,初染（结晶紫）媒染（卢戈氏碘液）脱色,（95%乙醇）复染（稀释石碳酸复红）,吸水纸,吸干,无菌操作（接种环灭菌和取菌）,涂片的厚度要适中,染色的时间控制，一一半半,冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗,五、注意事项,一 一 半 半,G,+,菌,G,-,菌,结晶紫,卢戈氏碘液,95%乙醇,石碳酸复红,初染,媒染,脱色,复染,六、结果,图一,图二,七、,临床意义,1、鉴别细菌,2、研究与致病性的,关系,3、指导临床用药,G,+,G,-,G,+,致病 外毒素,G,-,致病 内毒素,G,+,青霉素、头孢菌素等,G,-,链霉素、庆大霉素等,细菌的特殊结构（示教）,（二毛荚一胞）,从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。,功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H抗原）,菌发出比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛,功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质,荚膜,细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度0.2m边界明显者称为荚膜，厚度0.2m者称为微荚膜,功能：荚膜护菌强致病-抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗干燥作用、黏附作用,菌体内部物质缩水（60）形成圆或卵圆形小体。,功能：芽胞形态辨细菌，,灭菌标准抗力强。,实验报告,一、目的,二、原理（主要）,三、材料,四、方法,五、,结果（2+3幅图）,六、意义,七、注意事项,实验结果,1、绘制所涂片染色的G,+,及G,-,菌的形态图并注 明放大倍数,2、绘制示教片中各细菌特殊结构形态图并注明放大倍数,透镜,折光率,油 1.515 1.0 空气,玻 1.52 璃,空 气,油镜原理示意图,油镜的使用方法,寻找视野：,在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。,增大光照强度：,将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。,转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：,转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。,调试观察：,观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按：低倍高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。,清洗镜头：,油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯（或乙醚）擦去残余的香柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。,油镜的使用方法,革兰染色临床意义,临床意义,1、鉴别细菌,2、研究与致病,性的关系,3、指导临床,用药,G,+,G,-,G,+,致病 外毒素,G,-,致病 内毒素,G,+,青霉素、头孢菌素等,G,-,链霉素、庆大霉素等,医学微生物学实验一,细菌的形态学检查,实验报告书写,1.实验题目,2.实验目的,3.实验原理,4.实验材料,5.实验方法,6.实验结果,7.结果分析,8,.,实验意义,实验内容,一、光学显微镜油镜的使用和保护法,二、细菌的革兰染色检查法,三、细菌基本形态和特殊结构的观察,实验一 细菌的形态学检查,实验一 细菌的形态学检查,目的要求,1.掌握显微镜油镜的使用和保护。,2.掌握细菌的基本形态和特殊结构。,3.掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的步骤，判断革兰染色性及明确其临床意义。,一、显微镜油镜的使用和保护,显微镜的构造图,显微镜的使用方法,油镜头的辨认,显微镜的维护,油镜加香柏油的原理,玻璃折射率：,n=1.52,香柏油折射率：,n=1.515,二、细菌标本染色检查法,细菌个体微小，无色半透明，染色后能在显微镜下识别其各种不同结构，并鉴别细菌。,细菌染色法:,细菌特殊染色法,芽胞,鞭毛,丹麦细菌学家Gram于1884年发明的一种鉴别细菌的染色法。,可将细菌鉴别为革兰氏阳性G,+,菌和革兰氏阴性G,-,菌两大类。,革兰染色法,1.通透性学说,革兰氏阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌低，进入细胞的染料和碘液结合生成沉淀，脱色剂较易通过革兰氏阴性菌的细胞膜，将碘和染料的复合物溶解洗出，故易脱色；阳性菌细胞膜透通性低，故不易脱色。,革兰染色法原理,革兰染色法原理,2.等电点学说,革兰阳性菌等电点（PI23）比革兰阴性菌的等电点（PI45）低。在同一PH条件下，阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力较牢固，不易脱色。,动画演示,3.化学学说,革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成份，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和料染一煤染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。,革兰染色法原理,(一）实验材料,1.菌种 培养1824h的葡萄球菌、大肠杆菌,及白色念珠菌。,2.试剂 生理盐水、革兰氏染色液。,3.仪器及用具,接种环、酒精灯、玻片、显微镜、香柏油等。,细菌的革兰染色法,制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。,涂片,干燥,固定,（二）细菌涂片标本的制备,接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。,（二）细菌涂片标本的制备,1.涂片,取12环生理盐水（NS)置于载玻片上，,接种环用火焰烧灼灭菌。,1.涂片,（二）细菌涂片标本的制备,小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。,1.涂片,（二）细菌涂片标本的制备,再次灭菌试管口，棉塞略加烧灼放回原处。将接种环上之菌涂于载玻片的NS上，制成的菌膜直径约1cm左右均匀薄层。,接种环用火焰烧灼灭菌放回原处。,注：取菌量不应过多，以免造成菌体重叠。,1.涂片,（二）细菌涂片标本的制备,2.干燥,室温中自然干燥。,加速干燥，将标本离火焰半尺高处略烘。,（二）细菌涂片标本的制备,3.固定,目的：使细菌蛋白变性，菌体牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌。,玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆样速度通过三次，时间约3秒钟。,（二）细菌涂片标本的制备,初染（结晶紫.碳酸钠）,媒染（碘 液）,脱色（,丙酮酒精,）,复染（复红）,革兰染色法操作步骤：,初染 媒染 脱色 复染,结晶紫、碳酸钠30秒,革兰染色法,碘液媒染30秒,丙酮酒精数滴，脱色约5-10秒,碱性复红液23滴，5秒钟,待干，镜检。,注：每一步均需细流水冲洗。,油镜观察结果,1000,倍,放大倍数：,10100,白色念珠菌革兰染色,1000,倍,放大倍数：,10100,革兰氏染色意义：,1.鉴别细菌,2.选择抗菌药物,3.研究细菌致病性,G+菌能产生外毒素，G-菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。,1.脱色过度，可使 G,+,菌被误染为 G,-,菌；,2.脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，以涂片薄而均匀为好；,3.多种因素如菌龄、染色时间、pH等影响结果。,注意事项,实验报告内容,1.,绘图,葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌的基本示意图，记录革兰氏染色结果，分辨出革兰阳性菌和革兰阴性菌。,2.如果染色结果不理想，请分析原因。,细菌形态示意图绘图要求,1.选择形态典型的部分细菌，红兰色笔绘图。,2.绘细菌的形态、排列，细菌的大小比例应适宜，轮廓上（如球菌、杆菌）应有所区分。,注明,菌名：,大肠杆菌,染色法：,放大倍数：,10100,细菌形态示意图绘图要求,颜色,形态,排列,染色性,特殊结构,着色是否均匀,绘细菌的,Thanks,